蘇同偉，包斌,，嚴(yán)婷，張朝燕,3，卜永士，吳文惠,3

1 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306

2 上海水產(chǎn)品加工與貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306

3 上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)研究院，上海 201306

海洋微生物因其種類(lèi)多樣性及所處的高壓、低溫、缺氧等獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境，常常能夠產(chǎn)生優(yōu)良生物活性且結(jié)構(gòu)新穎的天然化合物[1]，海洋微生物代謝產(chǎn)物已經(jīng)成為創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)的重要來(lái)源[2-3]。

海洋微生物長(zhǎng)孢葡萄穗霉菌 FG216(Stachybotrys longispora FG216)是分離自東海海域的海洋真菌[4]，其代謝產(chǎn)物 FGFC1(Fungi fibrinolytic compound 1)是具有溶血栓作用[5]的小分子生物活性化合物，F(xiàn)GFC1特異作用于纖溶酶原和單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑，可使生理的纖溶反應(yīng)平穩(wěn)進(jìn)行，避免機(jī)體廣泛出血風(fēng)險(xiǎn)及過(guò)敏反應(yīng)，有可能成為安全而高效的溶血栓新藥。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Box-Behnken 模型[6-7]分析發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、誘導(dǎo)物(鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽)添加量對(duì)FGFC1產(chǎn)量的影響，從而得出FG216發(fā)酵生產(chǎn)FGFC1的最佳培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 菌株

長(zhǎng)孢葡萄穗霉菌 FG216(Stachybotrys longispora FG216)為本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得。保藏號(hào)：CCTCC M 2012227，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖35 g，可溶性淀粉10 g，脫脂大豆粉20 g，細(xì)菌學(xué)蛋白胨5 g，牛肉膏蛋白胨5 g，酵母提取物3 g，氯化鈉2 g，磷酸氫二鉀0.5 g，硫酸鎂0.05 g，加蒸餾水1000 mL，調(diào)pH至5.8，滅菌。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖50 g，硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀0.1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g ，酵母提取物1 g，氯化鈷0.0025 g，硫酸亞鐵0.015 g，氯化鈣0.0065 g，鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽，加蒸餾水1000 mL，調(diào)pH 至5.8，滅菌。

1.3 FGFC1標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系

精確稱(chēng)取FGFC1配制成甲醇標(biāo)準(zhǔn)液，并梯度稀釋為1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.1 mg/mL、0.05 mg/mL、0.01 mg/mL、0.005 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)樣品，用HPLC 進(jìn)行檢測(cè)，平行3次，以峰面積值為Y 軸，樣品濃度為X 軸作圖，得到FGFC1標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=9000000X，R2=0.9998。

1.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 誘導(dǎo)物添加量對(duì)FGFC1產(chǎn)量的影響

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為除去誘導(dǎo)物的發(fā)酵培養(yǎng)基，分別添加0.5%、1%、1.5%、3%、5%的誘導(dǎo)物。取活化的種子液按1%接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，考慮到海洋微生物大多為嗜冷微生物，其最適溫度在20℃以下，因此設(shè)定培養(yǎng)溫度為19℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，連續(xù)檢測(cè)3～9 d 發(fā)酵液中的FGFC1產(chǎn)量，誘導(dǎo)劑添加量各水平組中FGFC1產(chǎn)量均在第8天達(dá)到最高，以該培養(yǎng)時(shí)間的FGFC1產(chǎn)量確定最優(yōu)的誘導(dǎo)物添加量。

1.4.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)FGFC1產(chǎn)量的影響

取活化的種子液按1%比例接種到最優(yōu)誘導(dǎo)物添加量的發(fā)酵培養(yǎng)基中，因19℃時(shí)FGFC1產(chǎn)量較低，并初步探索FGFC1產(chǎn)量與培養(yǎng)溫度之間的關(guān)系，嘗試將培養(yǎng)溫度升高為22℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，3～9 d 取發(fā)酵液進(jìn)行FGFC1產(chǎn)量檢測(cè)以確定最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間。

1.4.3 培養(yǎng)溫度對(duì)FGFC1產(chǎn)量的影響

取活化的種子液按1%比例接種到最優(yōu)誘導(dǎo)物添加量的發(fā)酵培養(yǎng)基，比較1.4.1與1.4.2試驗(yàn)中升高溫度后FGFC1產(chǎn)量的變化趨勢(shì)，將培養(yǎng)溫度設(shè)定為19℃、22℃、25℃、28℃，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，在最優(yōu)的培養(yǎng)時(shí)間取發(fā)酵液對(duì)FGFC1產(chǎn)量檢測(cè)以確定最優(yōu)的培養(yǎng)溫度。

1.5 響應(yīng)面最優(yōu)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)Box-Behnken 模型以培養(yǎng)時(shí)間、誘導(dǎo)物添加量、培養(yǎng)溫度為自變量，以FGFC1產(chǎn)量為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)擬合自變量與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系[8-9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最優(yōu)的培養(yǎng)時(shí)間為8 d，最優(yōu)的誘導(dǎo)物添加量為1.5%，最優(yōu)的培養(yǎng)溫度為25℃。但各個(gè)單因素最優(yōu)條件簡(jiǎn)單的組合并不一定是發(fā)酵的最優(yōu)條件[10-11]，需要在單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)來(lái)確定最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)條件。選擇培養(yǎng)時(shí)間為7～9 d，誘導(dǎo)物添加量為0.5%～2.5%，培養(yǎng)溫度為22℃～28℃作為響應(yīng)面試驗(yàn)水平范圍，F(xiàn)GFC1產(chǎn)量為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 三因素響應(yīng)面試驗(yàn)分析

2.2.1 模型的建立及分析

以培養(yǎng)時(shí)間、誘導(dǎo)物添加量、培養(yǎng)溫度為試驗(yàn)因素，F(xiàn)GFC1產(chǎn)出量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照二次項(xiàng)回歸方程進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。

針對(duì)表1應(yīng)用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行多元回歸擬合[12-13]，可得培養(yǎng)時(shí)間(A)、誘導(dǎo)物添加量(B)、培養(yǎng)溫度(C)與響應(yīng)值FGFC1產(chǎn)量(Y)的關(guān)系，其方程式：Y＝1251.96+71.17A?393.62B+472.83C?45.54AB+65.53AC?371.54BC?93.60A2?119.98B2?380.91C2。

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，回歸模型的方差分析列入表2。

表1 培養(yǎng)時(shí)間、誘導(dǎo)物添加量、培養(yǎng)溫度的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及各試驗(yàn)的FGFC1產(chǎn)出量Table 1 The design of response surface methodology concerning fermentation time,ornithine hydrochloride quantity and fermentation temperature and the volume of production of FGFC1 from every experiment

表2 回歸模型方差分析Table 2 ANOVA of response surface model

根據(jù)表2可以看出，試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腜 值小于0.0001，模型極顯著，失擬項(xiàng)P 值為0.5432，大于0.05，這表示試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型擬合良好。通過(guò)對(duì)P值檢驗(yàn)可以看出，培養(yǎng)時(shí)間、誘導(dǎo)物添加量、培養(yǎng)溫度以及它們的二次項(xiàng)對(duì)FGFC1產(chǎn)量的影響都是顯著的，且誘導(dǎo)物與溫度的交互作用對(duì)FGFC1產(chǎn)量的影響同樣顯著。同時(shí)，模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9911，調(diào)整后R2=0.9796。從上述數(shù)據(jù)可以看出，此模型可以很好地反映FGFC1產(chǎn)量與培養(yǎng)時(shí)間、誘導(dǎo)物添加量、培養(yǎng)溫度之間的關(guān)系，可以用來(lái)對(duì)FGFC1產(chǎn)量進(jìn)行優(yōu)化分析與預(yù)測(cè)。

2.2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化及驗(yàn)證

在培養(yǎng)時(shí)間為8 d 時(shí)，誘導(dǎo)物添加量與培養(yǎng)溫度對(duì)FGFC1產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 誘導(dǎo)物添加量與培養(yǎng)溫度對(duì)FGFC1產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of ornithine hydrochloride addition and culture temperature on FGFC1 production.

通過(guò)響應(yīng)面結(jié)果分析，僅培養(yǎng)溫度與誘導(dǎo)物添加量之間交互作用顯著。培養(yǎng)溫度接近28℃時(shí)FGFC1產(chǎn)量最大，當(dāng)溫度達(dá)到28℃時(shí)其產(chǎn)量有所下降。而誘導(dǎo)物添加量為0.5%時(shí)，F(xiàn)GFC1的產(chǎn)量最大，隨后FGFC1的產(chǎn)量隨著誘導(dǎo)物添加量的增加而減少。

利用Design-Expert V8.0.6軟件對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最優(yōu)培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時(shí)間8.97 d，誘導(dǎo)物添加量0.5%，培養(yǎng)溫度27.8℃，F(xiàn)GFC1產(chǎn)量理論值為2077.77 mg/L。根據(jù)實(shí)際情況將最優(yōu)條件調(diào)整為培養(yǎng)時(shí)間9 d，誘導(dǎo)物添加量0.5%，培養(yǎng)溫度28℃。通過(guò)多次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到FGFC1產(chǎn)量均值為1978.33 mg/L，相對(duì)偏差為4.8%，表明Box-Behnken 模型用于FG216發(fā)酵條件的優(yōu)化是有效可靠的。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)利用Box-Behnken 模型對(duì)FG216發(fā)酵產(chǎn)生FGFC1的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，方差分析表明模型擬合度良好。最優(yōu)的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時(shí)間9 d，誘導(dǎo)物添加量0.5%，培養(yǎng)溫度28℃，通過(guò)培養(yǎng)條件優(yōu)化，F(xiàn)GFC1產(chǎn)量由優(yōu)化前的約700 mg/L 提高到1978.33 mg/L。結(jié)果表明，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間、誘導(dǎo)物添加量和培養(yǎng)溫度的響應(yīng)面優(yōu)化是成功有效的，為提高FGFC1的產(chǎn)量提供了技術(shù)支持，對(duì)保證后續(xù)的臨床前試驗(yàn)需求及加快FGFC1作為新型溶栓藥物出現(xiàn)具有重要意義。

長(zhǎng)孢葡萄穗霉菌FG216是一種稀有真菌，自1975年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)鮮有研究報(bào)道，其生物學(xué)特性尚未完全明確。相關(guān)研究[14-16]提示我們，可以從更多方面進(jìn)一步提高FGFC1的產(chǎn)量。

[1]Molinski TF,Dalisay DS,Lievens SL,et al.Drug development from marine natural products.Nat Rev Drug Discov,2009,8(1):69?85.

[2]Wang X,Wu WH,Chen ZH,et al.Research progress on bioactive metabolites from marine microorganism and their structures.Chin J Nat Med,2010,8(4):309?320(in Chinese).王幸,吳文惠,陳志華,等.海洋微生物次生代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征和生物活性的研究進(jìn)展.中國(guó)天然藥物,2010,8(4):309?320.

[3]Wang KM,Zhang YN,Zhang ZG,et al.Strategies for increacing the diversity of microbial secondary metabolites.Hubei Agri Sci,2010,49(12):3207?3210(in Chinese).王開(kāi)梅,張亞妮,張志剛,等.提高微生物次生代謝產(chǎn)物多樣性的策略.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,49(12):3207?3210.

[4]Zhang Y,Wu WH,Zhou PG,et al.Screening and isolation of fibrinolytic active compound from marine microorganism.Chin J Mar Drugs,2008,27(6):39?43(in Chinese).張艷,吳文惠,周培根,等.海洋微生物來(lái)源纖溶活性化合物的篩選及其分離.中國(guó)海洋藥物雜志,2008,27(6):39?43.

[5]Wang X,Wu WH,Sun LC,et al.Isolation of fibrinolytic active compound from marine fungi and initial identification of the strain.Nat Prod Res Dev,2012,24:57?61(in Chinese).王幸,吳文惠,孫立春,等.具有纖溶活性作用的海洋真菌代謝產(chǎn)物的分離與菌株鑒定.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2012,24:57?64.

[6]Wang H,Zhang L,Li JL.Response surface optimization of tannase production by Aspergillus niger.J Cent South Univ Technol,2011,31(10):122?126(in Chinese).王揮,張蕾,黎繼烈,等.響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)單寧酶條件.中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2011,31(10):122?126.

[7]Dong CH,Xie XQ,Wang XL,et al.Application of Box-Behnken design in optimisation for polysaccharides extraction from cultured mycelium of Cordyceps sinensis.Food Bioprod Process,2009,87(2):139?144.

[8]Zhang TR,Yu CQ.Optimization of mortierella isabellina culture conditions in fermentation of arachidonic acid by response surface methodology.Acad Period Farm Products Processing,2012(2):27?38(in Chinese).張?zhí)烊?于長(zhǎng)青.響應(yīng)面法優(yōu)化深黃被孢酶發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸的培養(yǎng)條件.農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊,2012(2):27?38.

[9]Niu GC,Yan BD,Zhu D,et al.Optimization of fermentation conditions for black currant fruit vinegar by response surface methodology.Food Sci,2012,33(1):157?160(in Chinese).牛廣財(cái),嚴(yán)寶冬,朱丹,等.響應(yīng)面法優(yōu)化黑加侖果醋的發(fā)酵條件.食品科學(xué),2012,33(1):157?160.

[10]Tong ZY,Zhou LP,Chen XF.Enhance of Monacolin K production by response surface methodology of Monascus purpureus WX.J Zhejiang Univ Technol,2007,35(1):35?40(in Chinese).童振宇,周立平,陳旭峰.響應(yīng)面法優(yōu)化紅曲霉菌株Monascus purpureus WX 液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K 工藝條件.浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,35(1):35?40.

[11]Zhao C,Ye LJ.Optimization of fermentation medium for spinosad production through response surface methodology.Chin J Antibiot,2010,35(12):945?950(in Chinese).趙晨,葉麗娟.利用響應(yīng)面方法優(yōu)化多殺菌素發(fā)酵培養(yǎng)基.中國(guó)抗生素雜志,2010,35(12):945?950.

[12]Shen NK,Wang QY,Lu Y,et al.Enhancing ethanol production using thermophilic yeast by response surface methodology.Chin J Biotech,2010,26(1):42?47(in Chinese).申乃坤,王青艷,陸雁,等.響應(yīng)面法優(yōu)化耐高溫酵母生產(chǎn)高濃度乙醇.生物工程學(xué)報(bào),2010,26(1):42?47.

[13]Zuo AL,Zhang WG.Medium optimization of SHMT formation by response surface analysis.Biotechnology,2008,18(3):45?49(in Chinese).左愛(ài)連,張偉國(guó).利用Design-Expert 軟件優(yōu)化絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基.生物技術(shù),2008,18(3):45?49.

[14]Li XY,Liu ZQ,Chi ZM.Production of phytase by a marine yeast Kodamaea ohmeri BG3 in an oats medium:optimization by response surface methodology.Biores Technol,2008,99(14):6386?6390.

[15]Wang HM,Zu GR,Yin L,et al.Optimization of chitinase production conditons of a marine bacterium by response surface methodology.China Brewing,2012,31(2):103?106(in Chinese).王慧敏,祖國(guó)仁,尹璐,等.響應(yīng)面法優(yōu)化海洋細(xì)菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)條件.中國(guó)釀造,2012,31(2):103?106.

[16]Hong M,Diao QY,Yan GL,et al.Optimization of culture conditions for silage lactic acid bacteria via a response surface technique.Chin J Animal Nutrition,2010,22(5):1307?1313(in Chinese).洪梅,刁其玉,閆貴龍,等.響應(yīng)面法優(yōu)化青貯飼料乳酸菌的培養(yǎng)條件.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2010,22(5):1307?1313.