孫鶴，郎志宏，朱莉，黃大昉

中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京 100081

植物中瞬時表達檢測是一種快速的、高通量的分析系統(tǒng)，它被廣泛地用于分析基因功能，如基因表達、亞細胞定位、蛋白活性及蛋白與蛋白的相互作用等[1-3]。常用的植物瞬時表達系統(tǒng)有洋蔥表皮細胞[4]、懸浮細胞[5]、愈傷組織[6]、煙草葉片[7]及原生質體[8-10]等。原生質體具有一致性，是比較均一的去除細胞壁的單細胞群體。原生質體處于相同的分離周期，導入的外源基因表達具有較好的同步性；同時不需進行長時間的組織培養(yǎng)，制備檢測過程僅需2 d 時間。原生質體瞬時表達體系為研究基因亞細胞定位和基因表達的調(diào)控提供了一種方便而有效的實驗系統(tǒng)。因此，原生質體瞬間表達系統(tǒng)至今已廣泛應用于各種研究，包括生產(chǎn)有用的代謝產(chǎn)物[11]、多倍體的產(chǎn)生[12]及植物信號機制研究等[13-16]。

1960年，Cocking 首次發(fā)表文章報道植物原生質體的分離方法[17]。盡管當時還沒有有效的DNA 導入方法，但原生質體已經(jīng)成為細胞壁再生、細胞分裂、胚的生成、分化及植物病毒研究的有效工具[18-19]。PEG 法[20]、電擊法[21]、顯微注射法[22]的發(fā)展使得原生質體瞬時表達的應用更為廣泛。報告基因GUS[23]、LUC[24]、GFP[25]的引入使得原生質體瞬時表達系統(tǒng)變得更為經(jīng)濟與方便。

擬南芥原生質體的制備條件較為完善，Sheen 實驗室建立了擬南芥葉片原生質體獲得以及轉化的標準方法，通過此方法可以從1 g 擬南芥葉片中獲得107個原生質體[26]。但通過此方法從1 g 玉米葉片中可獲取5×106個原生質體[27]，雖然完全可以滿足試驗需求，但遠不如擬南芥原生質體的產(chǎn)量，所以有望通過改良試驗條件進一步提高產(chǎn)量。小麥、水稻的原生質體雖已成功用于進行瞬時表達研究[28-31]，但還沒有建立一個標準的原生質體制備方法。本實驗從玉米、小麥、水稻原生質體分離過程中酶濃度、酶解時間和離心力大小等因素著手，分析這幾個關鍵因素對其原生質體產(chǎn)量及活力的影響，為玉米、小麥、水稻原生質體的制備和利用原生質體進行基因表達研究提供理論依據(jù)和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

將玉米(Zea mays L.，var.Zong 3)、小麥(Trticwm aestivwm L.，var.Chinese Spring)、水稻(Oryza sativa L.，var.Nipponbare)種子播種于土中(蛭石：泥炭土=1：1)，光照培養(yǎng)(光/暗周期為16 h/8 h)。

1.2 原生質體的分離

待葉片長度為10～15 cm 時(約10 d)，稱取1 g 葉片，切成0.5 mm 細絲。把切好的葉片移入含有40 mL 酶解液(1%、1.5%和2%纖維素酶R-10(Yakult，JAPAN)，0.3%、0.5%和0.7%離析酶R-10(Yakult，JAPAN)，0.4 mmol/L D-甘露醇，20 mmol/L KCl，20 mmol/L MES (2-(N-嗎啉)乙烷磺酸，pH 5.7)，55℃水浴鍋中加熱10 min，冷卻到室溫后，加入10 mmol/L CaCl2，5 mmol/L β-巰基乙醇，0.1% BSA，0.45μm 過濾)的燒瓶中，28℃黑暗中消化，采取振蕩酶解，轉速為50 r/min。

1.3 原生質體的純化

使用過濾網(wǎng)(200目)過濾酶解液，采取不同離心力進行離心(100×g、500×g 和1000×g)，離心時間設定為2 min，沉淀原生質體。移除上清液，加入預冷的緩沖液W5(154 mmol/L NaCl；125 mmol/L CaCl2；5 mmol/L KCl；2 mmol/L MES；pH 5.7)，輕輕旋轉試管洗滌沉淀，離心(100×g、500×g 和1000×g)2 min，棄上清液，加入500μL W5，重懸沉淀，置于冰上30 min。

1.4 試驗設計

依據(jù)已報道的文獻資料[32-36]，采取4因素3水平的正交設計方案對酶解液中兩種酶的濃度、酶解時間、離心力大小4個因素進行分析，每個因素取3個水平，纖維素酶濃度的選取3個水平分別為1%、1.5%和2%，離析酶濃度為0.3%、0.5%和0.7%；離心力大小為100×g、500×g 和1000×g。根據(jù)正交試驗極差分析得出原生質體制備的最適條件。

1.5 原生質體的計數(shù)

用W5稀釋原生質體溶液10倍，取少量上述原生質體懸浮液滴加在0.1 mm 血球計數(shù)板上。當原生質體充滿計數(shù)室后，在普通光學顯微鏡下觀察，并用細胞計數(shù)板測定原生質體的濃度：計算4個角上大格及中央大格(共5個大格)內(nèi)的原生質體個數(shù)，然后按公式計算原生質體數(shù)，每個樣品計數(shù)3個重復，最后計算出每克鮮重材料游離得到的原生質體產(chǎn)量(個/g FW)。原生質體產(chǎn)量(個/g FW)=5個大格內(nèi)總原生質體個數(shù)×104×稀釋倍數(shù)/葉片質量(g FW)。

1.6 原生質體的活性檢測

原生質體活力測定用0.01%二乙酸熒光素(FDA)染色，用熒光相差顯微鏡(Zeiss，Axio Imager A1)統(tǒng)計發(fā)綠色熒光的原生質體數(shù)和原生質體總數(shù)，原生質體活力以一個視野中有活力的原生質體占該視野中原生質體總數(shù)的百分數(shù)來表示，選取3個有代表性的視野進行統(tǒng)計，取平均值。

原生質體活力=(發(fā)綠色熒光的原生質體數(shù)/原生質體總數(shù))×100%。

1.7 原生質體轉化

原生質體轉化采用PEG-Ca2+介導法。將制備好的原生質體100×g 離心2 min，吸去上清，加入MMg 溶液(4 mmol/L MES，0.4 mol/L 甘露醇，15 mmol/L MgCl2)至原生質體的終濃度約為106個/mL。100μL 原生質體中加入質粒載體20μg，混勻后加入110μL 30%的PEG-Ca2+(30%PEG4000，0.2 mol/L 甘露醇，100 mmol/L CaCl2)溶液，混勻后于23℃孵育20 min。之后加入440μL 緩沖液 W5終止反應，200×g 離心2 min，吸去上清，加入260μL 緩沖液 WI(4 mmol/L MES，0.5 mol/L 甘露醇，5 mmol/L KCl)，混勻后加入24孔細胞培養(yǎng)板中(5%胎牛血清沖洗10 s)，23℃培養(yǎng)12～16 h。

1.8 實驗所用載體

本實驗所用載體為植物轉化載體pUFN，是由玉米泛素蛋白啟動子、綠色熒光蛋白(GFP)基因、胭脂堿合成酶終止子構成。

1.9 顯微觀察

吸取24孔細胞培養(yǎng)板中的原生質體20 L，滴于載玻片中央，利用激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM 710 META)觀察原生質體中GFP 的表達情況。激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為510 nm。統(tǒng)計發(fā)綠色熒光的原生質體個數(shù)和原生質體總數(shù)，轉化率以一個視野中發(fā)綠光的原生質體占該視野中原生質體總數(shù)的百分數(shù)來表示，選取3個有代表性的視野進行統(tǒng)計，取平均值。轉化率=(發(fā)綠色熒光的原生質體數(shù)/原生質體總數(shù))×100%。

2 結果

2.1 玉米原生質體的制備條件

利用正交分析法對影響玉米原生質體產(chǎn)量的幾個因素進行分析，利用細胞計數(shù)板進行計數(shù)(圖1A)。將不同條件下制備的原生質體的數(shù)量列表分析(表1)。從表1中的極差分析可知，纖維素酶濃度的R 值最大，說明這幾個因素中纖維素酶濃度對玉米葉肉原生質體分離影響最大；同時酶解時間的R 值也較大，說明酶解時間也是原生質體產(chǎn)量的重要影響因素。而離心力大小對產(chǎn)量影響不大，離心力過大會導致破碎的原生質體增多，影響原生質體活力，不利于后續(xù)融合、轉化等實驗。所以綜合原生質體產(chǎn)量、活力及酶解液中碎片數(shù)量等方面考慮，玉米幼葉原生質體的酶解最適條件為纖維素酶1.5%，離析酶0.5%，50 r/min 酶解7 h，100×g 離心2 min 收集，產(chǎn)量為7×106個/g FW。為了檢測玉米原生質體活力，采用FDA 對玉米原生質體進行染色(圖1B)，同時將含有綠色熒光蛋白的載體 pUFN 通過PEG-Ca2+法轉化玉米原生質體。在激光共聚焦顯微鏡下，GFP 熒光在細胞膜、細胞質和細胞核中均有分布(圖2)。統(tǒng)計視野下表達GFP 的原生質體個數(shù)和原生質體總數(shù)，得到玉米原生質體的轉化率為76.86%。

圖1 用細胞計數(shù)板對細胞進行計數(shù)(A)和FDA 染色檢測原生質體活力(B)Fig.1 Counting the number of cells by haemocytometer (A),and the viability of protoplasts detected by FDA staining (B).

表1 不同條件對分離玉米幼葉原生質體數(shù)量的影響Table 1 Effect of different conditions on the yield of protoplast from maize leaves

圖2 載體pUFN 瞬時轉化玉米原生質體Fig.2 Maize protoplasts transiently transfected with pUFN plasmid.(A) GFP excitation 488 nm.(B) Bright field.(C)A and B merged.Scale bar =50μm.

2.2 小麥原生質體的制備條件

采取與玉米原生質體制備相同的條件，隨著酶解時間的延長，原生質體的產(chǎn)量逐漸增加，酶解5 h 時其產(chǎn)量達到最高，酶解7 h 時，原生質體的產(chǎn)量及活力均大幅度下降，酶解液中碎片明顯增多，說明原生質體產(chǎn)量下降的原因是原生質體的大量破碎。因此綜合原生質體產(chǎn)量、活力及酶解液中碎片數(shù)量等方面考慮，小麥幼葉原生質體的酶解最適條件為纖維素酶1.5%，離析酶0.5%，50 r/min 酶解5 h，100×g 離心2 min 收集。細胞計數(shù)板計數(shù)及FDA 染色圖片見圖3。根據(jù)正交實驗結果(表2)，采取最佳分離條件進行進一步驗證，最適條件下原生質體產(chǎn)量達到6×106個/g FW。為了進一步證明原生質體的活力，我們將含有綠色熒光蛋白的載體pUFN 通過PEG-Ca2+法轉化小麥原生質體，利用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP 的表達情況，綠色熒光在細胞膜、細胞質和細胞核中均有分布(圖4)。經(jīng)統(tǒng)計，小麥原生質體的轉化率為55.79%。

2.3 水稻原生質體的制備條件

圖3 用細胞計數(shù)板對細胞進行計數(shù)(A)和FDA 染色檢測原生質體活力(B)Fig.3 Counting the number of cells by haemocytometer (A),and the viability of protoplasts detected by FDA staining (B).

表2 不同條件對分離小麥幼葉原生質體數(shù)量的影響Table 2 Effect of different conditions on the yield of protoplast from wheat leaves

圖4 載體pUFN 瞬時轉化小麥原生質體Fig.4 Wheat protoplasts transiently transfected with pUFN plasmid.(A) GFP excitation 488 nm.(B) Bright field.(C)A and B merged.Scale bar =50μm.

表3 不同條件對分離水稻幼葉原生質體數(shù)量的影響Table 3 Effect of different conditions on the yield of protoplast from rice leaves

與玉米小麥不同的是，切好的水稻條狀物漂浮在酶解液上面，接觸面積較小，酶解不充分，所以我們引入真空抽氣方法，大約5 min，直到葉片沉底，這樣大大節(jié)約了酶解時間，提高了酶解效率。從實驗結果分析可知(表3)，離心力大小的R 值最大，說明這幾個因素中離心力大小對水稻葉肉原生質體分離影響最大。在離心速度為100×g 和500×g 時，取上清液鏡檢，仍可看到較多數(shù)量的原生質體漂浮，說明在低速度離心條件下有較多的原生質體丟失。同時離析酶濃度的R值也較大，說明此因素也是影響原生質體產(chǎn)量的重要因素。所以水稻幼葉原生質體的酶解最適條件為纖維素酶2.0%，離析酶0.7%，50 r/min 酶解7 h，1000×g 離心2 min 收集。細胞計數(shù)板計數(shù)及FDA 染色圖片見圖5。根據(jù)正交實驗結果，采取最佳分離條件進行進一步驗證，最適條件下原生質體產(chǎn)量達到6×106個/g FW。為了進一步證明原生質體的活力，我們將含有綠色熒光蛋白的載體pUFN 通過PEG-Ca2+法轉化水稻原生質體，利用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP 的表達情況(圖6)。水稻原生質體的轉化率較高，可以達到81.17%。

圖5 用細胞計數(shù)板對細胞進行計數(shù)(A)和FDA 染色檢測原生質體活力(B)Fig.5 Counting the number of cells by haemocytometer (A),and the viability of protoplasts detected by FDA staining (B).

3 討論

從1985年開展瞬時表達研究以來，瞬時表達已經(jīng)廣泛應用于煙草、胡蘿卜、豆科、禾谷類作物(如玉米、水稻)及林木等。原生質體瞬時表達系統(tǒng)特別適于利用報告基因來研究基因的亞細胞定位。煙草、擬南芥原生質體系統(tǒng)已經(jīng)成功地用來研究基因的特性[4]，但是對于玉米、水稻、小麥來說，煙草、擬南芥屬于異源系統(tǒng)，異源系統(tǒng)中表達蛋白可能產(chǎn)生異常反應，可能會錯誤的定位[3]，所以研究者認為用同源的系統(tǒng)來研究蛋白定位更為科學和準確。

圖6 載體pUFN 瞬時轉化水稻原生質體Fig.6 Rice protoplasts transiently transfected with pUFN plasmid.(A) GFP excitation 488 nm.(B) Bright field.(C) A and B merged.Scale bar=50μm.

一般來說，植物各個器官，如：根、莖、葉、花、果實、種子及愈傷組織和懸浮細胞等都可作為分離原生質體的材料。種子易貯藏，由種子生長得到植物材料比較簡單容易，所以葉片是最易獲得的植物材料，而愈傷組織及懸浮細胞等需要長時間的組培過程，且愈傷與懸浮細胞的培養(yǎng)是在暗處，所以不利于研究與葉綠體相關的基因的表達。實驗證明新鮮分離的葉肉原生質體具有光合成活性及呼吸功能[37-38]，所以常被用來研究光/葉綠體相關過程[31]。

目前，用于植物原生質體分離的酶主要有纖維素酶、果膠酶、離析酶、半纖維素酶、崩潰酶、蝸牛酶等。酶濃度也隨酶解材料的不同而略有差異。分離葉片原生質體多采用纖維素酶和離析酶，所以本實驗對這兩種酶的最適濃度進行了摸索。同時，在其他條件相同的情況下，酶解時間越長，原生質體的產(chǎn)量越高，但破碎的細胞也隨之增多，影響后續(xù)的實驗。所以應控制酶解時間，以求在較短的時間內(nèi)獲得較多的原生質體。

本研究選用10日齡玉米、小麥、水稻幼苗葉片制備原生質體，通過正交試驗設計，篩選出較適合玉米、小麥、水稻原生質體分離的條件。玉米與小麥所用的酶濃度相同，都是1.5%纖維素酶和0.5%離析酶，區(qū)別在于玉米在解離7 h時，產(chǎn)量達到最大值，為7×106個/g FW；而小麥原生質體的分離所需的時間僅為5 h，即達到產(chǎn)量的最大值6×106個/g FW。說明小麥細胞壁與玉米相比，更容易被酶解。水稻由于葉片較輕，需要真空處理5 min，方能使葉片與酶解液充分接觸，保證酶解的有效進行。同時由于葉片厚度及細胞壁成分的影響，水稻原生質體的裂解需要較高濃度的酶：2.0%纖維素酶和0.7%離析酶。解離時間也較長，達7 h，產(chǎn)量為6×106個/g FW。

影響原生質體分離的因素較多，如反應液的滲透壓的調(diào)節(jié)，不適宜的滲透壓造成原生質體的脹裂。滲透壓的調(diào)節(jié)一般是通過在酶解液中加入滲透劑。滲透劑維持一定的滲透壓，使細胞處于質壁分離狀態(tài)，不致膨脹破裂，以提高原生質體的產(chǎn)率與活力。不同植物材料游離原生質體時所用的滲透劑種類和濃度不盡相同[39-41]。本實驗采用0.4 mol/L 甘露醇作為滲透劑，對玉米、小麥和水稻的分離均較好。本實驗在酶解原生質體時，采用的是50 r/min 低速振蕩的方法。原因是低速振蕩增加了酶解液與進行酶解的材料的接觸，同時還增加了氧氣的供應，有利于原生質體的釋放。

本實驗只對影響原生質體分離的主要影響因素進行了初步摸索，原生質體酶解的過程中，還有很多需要考慮的因素，比如酶解液的pH 值、酶的純度、酶解溫度、植物生長的條件等[42]。所以還應做更多詳細的實驗來進一步提高分離原生質體的數(shù)量和質量。

我們對玉米、小麥和水稻原生質體的制備條件進行了初步摸索，為利用原生質體進行研究奠定了基礎。為了更好地利用原生質體研究基因的表達、定位等，與原生質體轉化效率有關的其他實驗條件，比如質粒DNA 的純度、DNA 與原生質體的比例及原生質體純度等都需要進行分析。同時DNA 轉化方法也需要實驗優(yōu)化，比如擬南芥原生質體轉化通常用PEG 轉化法，玉米原生質體轉化通常用電擊法效率更高[16]。本實驗采用相同條件的PEG 轉化方法對玉米、小麥、水稻原生質體進行轉化，轉化率各不相同。玉米的轉化率為76.86%，小麥的轉化率為55.79%，水稻的轉化率較高，達到81.17%。2001年，Sheen 等利用PEG 法轉化玉米原生質體，轉化率為75%[9]，本研究的結果與之接近。利用PEG 法轉化水稻原生質體，Takai 等的轉化率為40%[43]，Zhang等的轉化率達到53%～75%[44]。據(jù)報道，原生質體轉化效率與載體大小有關。在水稻原生質體轉化中，4.5 kb 的載體轉化率為60%～70%，而12 kb的載體轉化率在25%～30%[30]。本實驗在水稻原生質體中獲得了較高的轉化率，而小麥的轉化率相對較低，可以通過調(diào)整轉化條件來改善，比如延長載體孵育時間，或者改變PEG 濃度等。

隨著原生質體分離方法和基因工程技術的不斷完善，原生質體瞬時表達系統(tǒng)將以其獨有的優(yōu)勢在植物分子生物學研究中得到更加廣泛的應用。

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