張 敏，劉宗平，于圣青

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

布魯氏菌是一種革蘭氏染色陰性，胞內(nèi)寄生的短小桿菌，無(wú)鞭毛，不形成芽胞。布魯氏菌屬可分為6個(gè)種，即羊種，牛種，豬種，綿羊型副睪種，沙林鼠種和犬種。最近在海洋生物中又分離到海洋型布魯氏菌。其中，羊種布魯氏菌和牛種布魯氏菌的危害較大[1]。布魯氏菌可感染包括人在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物引起布魯氏菌病。公畜多表現(xiàn)為睪丸炎和附睪炎；母畜多發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎；人感染后多引發(fā)關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎和神經(jīng)損傷，且久治不愈[2]。故布魯氏菌病不僅在畜牧生產(chǎn)上造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重威脅到公共衛(wèi)生安全[3]?？刂撇⒆罱K消滅布魯氏菌病的最有效策略是接種疫苗。常用來(lái)預(yù)防羊種布魯氏菌病的疫苗株有Rev1[4]，預(yù)防牛種布魯氏菌病的疫苗株有S19和RB51[5]，但都存在一定的缺點(diǎn)。Rev1是Elbrg等[6]在1957年從鏈霉素培養(yǎng)基上選育出的光滑型減毒株，對(duì)牛種、羊種布魯氏菌均具有免疫力和保護(hù)力，但此菌株作為疫苗仍具有相當(dāng)?shù)亩玖?，并且在適當(dāng)?shù)臈l件下毒力可以完全恢復(fù)，且免疫動(dòng)物后會(huì)干擾臨床診斷。S19是1923年在牛奶中發(fā)現(xiàn)的有毒菌株，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)過(guò)程中弱化為減毒株，其完整的LPS結(jié)構(gòu)可持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，對(duì)牛有一定的保護(hù)力[7]。S19作為疫苗在防治布氏桿菌感染中應(yīng)用廣泛，但其缺點(diǎn)是可引起懷孕母畜流產(chǎn)，且免疫后引起高水平抗體效價(jià)，在篩查時(shí)難以區(qū)分人為免疫和自然感染。RB51是野生毒株S2308在利福平和青霉素抗性選擇培養(yǎng)基上多重傳代后自發(fā)形成的粗糙型菌株，該疫苗可以產(chǎn)生細(xì)胞免疫和攻毒保護(hù)作用，且不會(huì)擾亂常規(guī)的診斷方法，但其有抗生素抗性，為臨床治療用藥帶來(lái)困擾。因此，研制更為安全有效、易于臨床診斷的布魯氏菌減毒活疫苗受到廣泛關(guān)注。布魯氏菌不存在Ⅰ、Ⅱ型分泌系統(tǒng)，沒(méi)有毒力島、菌毛、纖毛、粘附素及毒素等典型的毒力基因，其致病機(jī)理主要和胞內(nèi)存活有關(guān)[8]。脂多糖（LPS）是布魯氏菌外膜的主要成分，在逃逸宿主先天免疫捕獲和靶定細(xì)菌到復(fù)制小環(huán)境中起作用[9]，是一種重要的毒力因子。LPS的表型分為光滑型和粗糙型兩種，對(duì)LPS合成所需酶的編碼基因進(jìn)行突變可導(dǎo)致產(chǎn)生結(jié)構(gòu)不完整的LPS，可導(dǎo)致布魯氏菌的表型由光滑型轉(zhuǎn)變?yōu)榇植谛?。大部分粗糙型布魯氏菌菌株的毒力較弱，經(jīng)常被用作減毒活菌苗候選株進(jìn)行研究。本文針對(duì)布魯氏菌脂多糖及其突變株的研究進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

1 布魯氏菌LPS的結(jié)構(gòu)

LPS對(duì)于革蘭氏陰性菌外膜的結(jié)構(gòu)和功能完整至關(guān)重要[10]，由3個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，即類脂A（內(nèi)毒素性質(zhì)）、核心寡聚糖和O抗原側(cè)鏈[11]組成。布魯氏菌LPS的類脂A骨架是由2,3-二氨基-2,3-雙脫氧 -D- 葡萄糖構(gòu)成的，并在 C16：0到 C18：0范圍內(nèi)由飽和脂肪酸修飾，3-OH-C12：0到 29-OH-C30：0范圍內(nèi)由羥化脂肪酸修飾。與經(jīng)典的革蘭氏陰性菌LPS不同，其葡萄糖胺長(zhǎng)鏈與?；L(zhǎng)鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)單一酰胺鍵與核心相連，而不是通過(guò)酯和酰胺相連[12]。布魯氏菌LPS核心寡聚糖與類脂A相連，包括甘露糖、葡萄糖、葡糖胺、奎諾糠胺、3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸（KDO）和其他未研究清楚的糖殘基[10]。光滑型布魯氏菌LPS的O抗原連在核心寡聚糖上，是1,2-鏈-4,6-雙脫氧-4-甲酰氨基-α-D-甘露吡喃糖亞單位的線性同聚物[13]，平均鏈長(zhǎng)96～100個(gè)糖基單位（圖1）。粗糙型LPS缺少O抗原組分，毒力比光滑型弱。

經(jīng)典的革蘭氏陰性菌LPS是病原相關(guān)分子模式，可以被先天免疫系統(tǒng)的病原識(shí)別受體感知，觸發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)毒素性質(zhì)的休克。布魯氏菌不具備經(jīng)典的LPS結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)上的差異是其逃避先天性免疫防線，在宿主細(xì)胞內(nèi)生存、復(fù)制并造成慢性感染的原因之一。

圖 1 布魯氏菌 LPS 結(jié)構(gòu)模式圖（引自 Andreas F.Haag “Importance of lipopolysaccharide and cyclic β-1, 2-glucans in Brucella-mammalian infections）Fig.1 The LPS structure of Brucella (From Andreas F.Haag “Importance of lipopolysaccharide and cyclic β-1, 2-glucans in Brucella-mammalian infections)

2 布魯氏菌LPS的生物合成及所需酶的編碼基因

布魯氏菌LPS的生物合成過(guò)程并沒(méi)有徹底研究清楚，但是現(xiàn)有的研究結(jié)果表明其合成過(guò)程與經(jīng)典的革蘭氏陰性菌相似，由相關(guān)酶類催化在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)合成類脂A，隨后在各種糖基轉(zhuǎn)移酶的連續(xù)作用下，將糖基合成到類脂A骨架上，最后是將2個(gè)KDO殘基合成到類脂A骨架上，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜周質(zhì)側(cè)。O抗原在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)以獨(dú)立的方式合成后連接到類脂A的受體糖上，通過(guò)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)蛋白轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)運(yùn)到膜的周質(zhì)側(cè)，在周質(zhì)側(cè)由蛋白連接酶催化綁定到完整的類脂A/核上[4]（圖2）。

圖 2 布魯氏菌 LPS 合成模式圖（引自 Andreas F.Haag “Importance of lipopolysaccharide and cyclic β-1, 2-glucans in Brucella-mammalian infections”）Fig.2 The LPS synthesis mode of Brucella (From Andreas F.Haag “Importance of lipopolysaccharide and cyclic β-1, 2-glucans in Brucella-mammalian infections”)

布魯氏菌僅以葡萄糖作為碳源，其將葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌欠肿訌亩铣蒐PS。布魯氏菌LPS的合成涉及多種酶類，已報(bào)道的有磷酸葡萄糖變位酶（pgm）、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶（wa**）、磷酸甘露糖異構(gòu)酶（manAOAg）、磷酸甘露糖變位酶（manBOAg/pmm/ manBcore）、甘露糖-1-磷酸鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)移酶（manCOAg/manCcore）、GDP甘露糖脫水酶（gmd）、過(guò)骨胺合成酶（per）、甲?；D(zhuǎn)移酶（wbkC）、糖基轉(zhuǎn)移酶（wbkA/wbkE/wboA/wboB）、異構(gòu)酶/脫水酶（wbkD）和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)蛋白轉(zhuǎn)移酶（wzm/wzt）等[5,9,14]。這些酶的編碼基因廣泛分布于布魯氏菌的兩條染色體上[15]，類脂A/核合成所涉及酶的編碼基因分別位于染色體Ⅰ和染色體Ⅱ上，而O抗原合成所涉及酶的編碼基因大部分在染色體Ⅰ的wbk區(qū)域，還有兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因位于染色體Ⅰ的wbo區(qū)域。布魯氏菌LPS合成過(guò)程中涉及酶的編碼基因命名規(guī)則為（1），編碼類脂A合成早期所需酶的基因一般命名為lpx*；（2），編碼類脂A合成晚期所需酶的基因，或參與O抗原連接到類脂A/核上的基因命名為wa**；（3），編碼O抗原合成過(guò)程中所涉及酶的基因命名為wb**；（4），編碼O抗原處理過(guò)程中所涉及酶的基因命名為wz*[16]。此外，編碼前期途徑所需酶的基因符合常規(guī)命名法，例如man*參與甘露糖（mannitose）合成，per為過(guò)骨胺（perosamine）合成酶編碼基因。

在初步了解布氏桿菌LPS生物合成過(guò)程的基礎(chǔ)上，對(duì)其合成所涉及酶的編碼基因進(jìn)行分類，對(duì)參與LPS同一結(jié)構(gòu)域合成酶的編碼基因分別突變，得到不同的突變株，對(duì)其功能進(jìn)行比較，有助于了解LPS三個(gè)結(jié)構(gòu)域在逃避先天性免疫防線、在宿主細(xì)胞內(nèi)生存起的作用，是分析布魯氏菌致病機(jī)理的手段之一。

3 布魯氏菌LPS突變株

布魯氏菌LPS是一種重要的毒力因子，對(duì)其合成所需酶的編碼基因進(jìn)行突變可導(dǎo)致產(chǎn)生毒力減弱的粗糙型突變株，因此經(jīng)常被用于減毒活菌苗的研究。在了解布魯氏菌LPS的結(jié)構(gòu)和生物合成之后，研究者們對(duì)其合成所需酶的編碼基因進(jìn)行各種突變，產(chǎn)生多株相應(yīng)的缺失株。這些缺失株大致可以分為三類，即:（1）LPS的類脂A/核有不同程度的缺失，伴隨/不伴隨O抗原在胞質(zhì)側(cè)積聚；（2）LPS的類脂A/核完整，但O抗原側(cè)鏈缺失；（3）LPS的類脂A/核完整，但O抗原側(cè)鏈以游離狀態(tài)存在。下面逐一進(jìn)行闡述。

3.1 類脂A/核合成相關(guān)基因突變株pgm編碼磷酸葡萄糖變位酶，參與ADP-葡萄糖、UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖的生成，為寡聚糖鏈和O抗原合成提供必需的原材料。Juan E.Ugalde等[17]通過(guò)插入慶大霉素抗性盒誘變牛種布魯氏菌pgm基因，獲得B2211突變株。該突變株O抗原不完整，為粗糙型，其在小鼠體內(nèi)不能存活，但在HeLa細(xì)胞中可以復(fù)制，證明該缺失株并沒(méi)有改變細(xì)菌的侵襲力和細(xì)胞內(nèi)增殖情況。David González等[14]通過(guò)轉(zhuǎn)座子插入的方法在羊種布魯氏菌中誘變pgm基因，得到類脂A/核和O抗原均不完整的粗糙型突變株，該突變株在小鼠體內(nèi)減毒并最終被清除，對(duì)羊種布魯氏菌產(chǎn)生強(qiáng)于PBS對(duì)照弱于Rev1的保護(hù)力。Allen等[18]使用轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)突變技術(shù)獲得多株牛種布魯氏菌粗糙型突變株，其中一株的Pmm/manB基因由于轉(zhuǎn)座子插入而失活，使得磷酸甘露糖變位酶無(wú)法合成，導(dǎo)致6-磷酸-甘露糖、1-磷酸-甘露糖無(wú)法轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生一株類脂A/核不完整、O抗原不存在的粗糙型突變株，該缺失株在小鼠體內(nèi)存活能力下降，并且對(duì)多粘菌素B敏感性增加。Monreal等[19]用轉(zhuǎn)座子插入方法突變了牛種布魯氏菌5個(gè)基因，其中manBcore突變株LPS缺少外核抗原表位，在小鼠體內(nèi)減毒，但對(duì)牛種布魯氏菌沒(méi)有有效的保護(hù)力。Raquel Conde-lvarez等[11]運(yùn)用結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法得到牛種布魯氏菌糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因wadC的缺失株，該缺失株類脂A/核突變但不引起O抗原改變，在BALB/c小鼠和DC細(xì)胞上毒力減弱，且誘導(dǎo)強(qiáng)烈的促炎反應(yīng)，證明了布魯氏菌LPS的核起到抵抗先天免疫識(shí)別的屏障作用。上述研究結(jié)果表明完整的類脂A/核對(duì)產(chǎn)生高效免疫保護(hù)作用十分重要。

3.2 O抗原合成相關(guān)基因突變株wbkA、wbkC、wbkD、wbkE、wbkF、manAO-Ag、manBO-Ag、manCO-Ag、wboA和per等基因參與O抗原的生物合成。wbkA基因編碼N甲?；?過(guò)骨胺酰轉(zhuǎn)移酶，Monreal[19]等以帶有卡那霉素抗性的Tn5轉(zhuǎn)座子插入牛種布魯氏菌的wbkA基因，得到O抗原缺失的BA2.17減毒疫苗株，對(duì)牛種布魯氏菌產(chǎn)生強(qiáng)于PBS對(duì)照弱于S19、RB51的保護(hù)力。Godfroid等[13]獲得了羊種布魯氏菌的wbkB基因缺失株，但其LPS結(jié)構(gòu)并未發(fā)生變化。wbkC編碼轉(zhuǎn)甲酰酶，在LPS的O抗原鏈合成時(shí)GDP-4-氨基-4,6-雙脫氧甘露糖轉(zhuǎn)化為GDP-4-甲酰氨基-4,6-雙脫氧甘露糖過(guò)程中起催化作用，Thaís Lourdes等[5]采用同源重組的方法獲得牛種布魯氏菌的wbkC基因突變株。該突變株為不具有利福平抗性的粗糙型菌株，可在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生與RB51相似但弱于S19的保護(hù)性，并且不會(huì)干擾血清學(xué)診斷，是較為理想的疫苗候選株。González等[14]通過(guò)Tn5轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變構(gòu)建缺失庫(kù)，在wbk區(qū)域又鑒定到wbkD、wbkE、wbkF以及manAO-Ag、manBO-Ag、manCO-Ag等基因。其中wbkD與奎諾糠胺合成有關(guān)；wbkF參與催化乙?；被寝D(zhuǎn)移，從而啟動(dòng)O抗原側(cè)鏈聚合；manAO-Ag、manBO-Ag、manCO-Ag參與葡萄糖轉(zhuǎn)化為O抗原合成原料甘露糖。Vemulapalli等[20]鑒定牛種布魯氏菌RB51是wboA基因缺失株，而McQuiston等[21]在牛種布魯氏菌S2308 得到的wboA缺失株并不像RB51一樣減毒，但產(chǎn)生的保護(hù)性高于RB51。這表明布魯氏菌RB51株還有一個(gè)附加基因發(fā)生遺傳變異，該基因可能參與O抗原轉(zhuǎn)移，也可能參與抗原與類脂A/核偶聯(lián)。Winter等[22]在羊種布魯氏菌和豬種布魯氏菌上缺失wboA分別產(chǎn)生粗糙型缺失株VTRM1和VTRS1，但未檢測(cè)到類脂A /核和O抗原缺失。per編碼過(guò)骨胺合成酶，作為甲?；饔玫牡孜?，進(jìn)一步聚合形成O抗原。Godfroid等[23]完全裂解per使16M馬耳他布魯氏菌喪失了O鏈生物合成的能力，并證明了該基因突變只影響O抗原早期的生物合成，不影響O鏈轉(zhuǎn)移到外膜。

3.3 O抗原轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因突變株由于布魯氏菌特殊的O抗原結(jié)構(gòu)，其合成后連接到類脂A/核上是所謂的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)依賴型機(jī)制。rfbD（wzm）和rfbE（wzt）分別合成ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)運(yùn)載體和ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)ATP酶，參與LPS的O抗原從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)側(cè)，并為之提供能量。Godfroid等[13]對(duì)羊種布魯氏菌16M菌株進(jìn)行wzm和wzt基因突變，獲得了粗糙表型的缺失株，該缺失株與光滑型LPS的O抗原單克隆抗體無(wú)反應(yīng)性，表明在細(xì)菌表面缺失O抗原。Zhang等[24]應(yīng)用同源重組的方法以SacB反向篩選基因構(gòu)建了牛種布魯氏菌S2308株的rfbD（wzm）和rfbE（wzt）的無(wú)痕缺失株，并證明了其為粗糙型減毒株，免疫小鼠可獲得100%的攻毒保護(hù)。

通過(guò)缺失LPS合成所需酶的編碼基因得到不同類型的突變株，對(duì)其功能進(jìn)行比較。結(jié)果證明不僅布魯氏菌LPS的O-抗原，其類脂A及核心寡聚糖均與布魯氏菌的毒力相關(guān)。因此，在設(shè)計(jì)減毒活疫苗候選株時(shí)，要充分考慮布魯氏菌LPS的結(jié)構(gòu)、生物合成和所涉及酶編碼基因，以便得到效果最佳的粗糙型疫苗候選株。

4 布魯氏菌脂多糖突變株的應(yīng)用展望

布魯氏菌病為人畜共患病，該病嚴(yán)重威脅著畜牧業(yè)的健康發(fā)展，同時(shí)影響著人類的公共衛(wèi)生安全。在該病的多發(fā)疫區(qū)，使用疫苗是有效的防控方法。傳統(tǒng)的減毒活菌疫苗有很好的免疫保護(hù)能力，但存在殘余毒力強(qiáng)、干擾血清學(xué)診斷、引起動(dòng)物流產(chǎn)等諸多缺陷。由于布魯氏菌為胞內(nèi)寄生菌，機(jī)體清除該菌主要依靠細(xì)胞免疫，故對(duì)布魯氏菌病疫苗的研究主要集中在構(gòu)建、篩選和鑒定減毒疫苗候選株[25]。

布魯氏菌脂多糖的內(nèi)毒素性質(zhì)要比其他革蘭氏陰性菌的弱幾百倍，而且其能夠抑制補(bǔ)體和抗菌肽對(duì)菌體的攻擊，通過(guò)抑制細(xì)胞因子之類的免疫介質(zhì)合成來(lái)抑制宿主的先天免疫，從而幫助細(xì)菌存活。因此，布魯氏菌LPS是一種重要的毒力因子。脂多糖由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，大量結(jié)果已經(jīng)證明不僅O抗原，布魯氏菌LPS的類脂A/核也與其毒力息息相關(guān)。所以，針對(duì)目前了解的布魯氏菌脂多糖的結(jié)構(gòu)、生物發(fā)生和合成所需酶編碼基因去設(shè)計(jì)構(gòu)建最大程度減毒、安全性和保護(hù)性最佳的突變疫苗株意義重大。布魯氏菌脂多糖粗糙型突變株作為疫苗候選株的優(yōu)勢(shì)在于:（1）能激發(fā)宿主對(duì)細(xì)菌的天然免疫，在宿主體內(nèi)持續(xù)存活并最終被清除，刺激機(jī)體產(chǎn)生全面而持久的免疫力；（2）可產(chǎn)生高效的保護(hù)效果，但不干擾臨床診斷；（3）反向遺傳技術(shù)的應(yīng)用避免了偶爾毒力回復(fù)的問(wèn)題。但同時(shí)布魯氏菌脂多糖突變株作為疫苗也存在潛在的缺陷。（1）如果粗糙型減毒株對(duì)人畜具有感染性，標(biāo)準(zhǔn)血清無(wú)法監(jiān)測(cè)到；（2）雖然普遍觀點(diǎn)認(rèn)為體液免疫在布魯氏菌感染中不起作用，但現(xiàn)在的研究并不能完全否定針對(duì)O抗原產(chǎn)生抗體的作用；（3）粗糙型減毒株在體內(nèi)清除過(guò)快，可能會(huì)導(dǎo)致抗原刺激不足。此外，粗糙型減毒株對(duì)光滑型強(qiáng)毒株感染的不同動(dòng)物產(chǎn)生的保護(hù)力存在差別。目前，可以通過(guò)運(yùn)用選擇性培養(yǎng)基分型、有針對(duì)性的PCR擴(kuò)增以及應(yīng)用LPS其他結(jié)構(gòu)的抗體進(jìn)行血清學(xué)診斷等方法監(jiān)測(cè)具有感染性的粗糙型減毒缺失株；同時(shí)不同缺失株保護(hù)力存在差別說(shuō)明不只O抗原，類脂A、核心寡聚糖結(jié)構(gòu)也與毒力相關(guān)；但是針對(duì)O抗原產(chǎn)生的抗體在布魯氏菌感染中的作用還需要進(jìn)一步探究。

LPS是布魯氏菌主要致病因子，通過(guò)突變相關(guān)基因產(chǎn)生粗糙型減毒缺失株，可以為研制布魯氏菌病減毒活疫苗提供物質(zhì)基礎(chǔ)，但是若要在臨床上廣泛應(yīng)用還需要更深入的研究。

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