徐瑞敏，李運(yùn)燕,2，段明明，劉 群,2，苑純秀，楊健美，馮新港

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241; 2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

日本血吸蟲病是一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的寄生蟲病，至今仍然嚴(yán)重影響我國人、畜的健康和經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展[1]。安全有效的疫苗的成功開發(fā)與應(yīng)用是最終實(shí)現(xiàn)控制血吸蟲病目標(biāo)的技術(shù)保障[2]。目前，公認(rèn)的具有較高的保護(hù)性效果的疫苗是輻照致弱的尾蚴或童蟲疫苗RAV（radiation attenuated vaccine）[3]，但由于材料來源和安全性等問題，RAV仍未推廣應(yīng)用。一般認(rèn)為，通過模擬RAV的效應(yīng)機(jī)制來開發(fā)血吸蟲疫苗可能是一條值得探索的新途徑。盡管對(duì)RAV誘導(dǎo)的宿主產(chǎn)生的高保護(hù)性免疫應(yīng)答的機(jī)制有所了解，但RAV的蟲源性的分子基礎(chǔ)和機(jī)制仍然不明。據(jù)Hedstrom等[4]報(bào)道，SmHSP70為RA曼氏血吸蟲疫苗的一種重要的免疫原；Yang 等[5]通過應(yīng)用蛋白質(zhì)組技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較紫外致弱的日本血吸蟲尾蚴轉(zhuǎn)化來的童蟲的SjHSP70呈現(xiàn)高表達(dá)，他們研究小組進(jìn)一步將含SjHSP70分子的DNA疫苗免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生偏向于Th1的免疫應(yīng)答，且產(chǎn)生了一定的抗血吸蟲攻擊感染的免疫保護(hù)效果[6]。我們的前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，SjHSP70在輻照日本血吸蟲尾蚴轉(zhuǎn)化來的童蟲（4 d和7 d）細(xì)胞表面呈高表達(dá)；另一個(gè)應(yīng)急分子鈣網(wǎng)蛋白SjCRT在RA血吸蟲童蟲（7 d）來源細(xì)胞中也呈高表達(dá)，且可以刺激小鼠樹突細(xì)胞（DC）表型的成熟[7]。因此我們推斷:在RAV模型中，血吸蟲的應(yīng)急分子如熱休克蛋白70（SjHSP70）、鈣網(wǎng)蛋白（SjCRT）以及高遷移蛋白1（SjHMGB1）等可能在活化宿主的抗原提呈細(xì)胞如DC、極化CD4+T細(xì)胞、以及增強(qiáng)RAV的免疫原性等方面發(fā)揮了重要的作用。

為實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)SjHSP70是否具有上述免疫生物學(xué)功能，必需獲得一定數(shù)量的蟲源的或是重組的SjHSP70蛋白。由于蟲體材料來源受到極大地限制，故一般采用原核或真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來獲得目的蛋白。已報(bào)道的血吸蟲SjHSP70蛋白免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)使用的都是原核表達(dá)的重組蛋白，或直接使用DNA疫苗劑型[5]，考慮到原核表達(dá)重組蛋白可能帶來內(nèi)毒素的污染，從而有可能影響對(duì)SjHSP70相關(guān)的免疫學(xué)功能的評(píng)價(jià)。本研究利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，在真核細(xì)胞Sf9中表達(dá)了SjHSP70，為進(jìn)一步研究SjHSP70免疫學(xué)特征及其在RAV模型中所發(fā)揮的作用等提供材料。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體和細(xì)胞日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫、桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTA及其野生型毒株、Sf9 昆蟲細(xì)胞、DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京天根生物科技有限公司。

1.2 主要試劑ExTaq聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ、T4 DNA連接酶、DNA純化試劑盒及小型質(zhì)粒抽提試劑盒均購自購自大連寶生物工程有限公司；DNA分子標(biāo)準(zhǔn)物購自北京天根生物科技有限公司；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)物購自麥約爾生物技術(shù)有限公司；ODYSSEY anti-Mouse IRDye 800CW購自上海儀濤生物有限公司；Ni-NTA His-Bind 樹脂、Ni-NTA緩沖液試劑盒、昆蟲細(xì)胞裂解液購自Novagen公司；LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、SF900 Ⅲ無血清培養(yǎng)基、FBS、Alexa Fluor@488 goat anti-mouse IgG（H+L）購自上海Invitrogen 公司；SjHSP70原核表達(dá)蛋白[8]及該蛋白免疫鼠源血清、血吸蟲感染鼠的陽性血清均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank（登錄號(hào):AY813185）的SjHSP70基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增該基因全長序列，其中:上游引物: 5'- CGGGATCCA TGTCTCGTAACTTGTTGTTA-3'; 下 游 引 物: 5'-CCGGAATTCTTACTGCTTCTC; CTGTTTAG -3'。上下游引物的5'端分別加入BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引物由上海Invitrogen公司合成。以日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 程序設(shè)定:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性 45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸 2 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存；將擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，按照DNA純化試劑盒操作進(jìn)行產(chǎn)物純化回收。

1.4 pFastBacHTA-SjHSP70轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建純化后的PCR 產(chǎn)物和pFastBacHTA載體用BamHⅠ和EcoRⅠ37℃雙酶切后分別純化回收，T4 DNA 連接酶、16℃恒溫水浴鍋過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板，37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜，挑克隆過夜培養(yǎng)，取菌液進(jìn)行PCR鑒定，陽性者再抽質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，并送至上海桑尼公司科技有限公司測序。陽性質(zhì)粒命名為pFastBacHTA-SjHSP70。

1.5 重組穿梭質(zhì)粒reBacmid-SjHSP70的構(gòu)建和鑒定將重組的pFastBacHTA-SjHSP70質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH10Bac細(xì)胞，涂布于X-gal培養(yǎng)板，37℃倒置培養(yǎng)24～48 h，通過藍(lán)白斑篩選出陽性克隆，經(jīng)SjHSP70特異性引物及Bac-To-Bac桿狀病毒載體通用引物[7]兩次PCR鑒定穿梭質(zhì)粒reBacmid-SjHSP70。按照質(zhì)粒抽提試劑盒操作手冊(cè)提取重組桿狀病毒穿梭載體reBacmid-SjHSP70。

1.6 reBacmid-SjHSP70轉(zhuǎn)染 Sf9昆蟲細(xì)胞將 2 μL重組質(zhì)粒和 5 μL 脂質(zhì)體分別加入 100 μL Grace's Insect培養(yǎng)基中稀釋混勻，室溫下孵育30 min。加入800 μL SF900 Ⅲ無血清培養(yǎng)基，混勻后轉(zhuǎn)染處于對(duì)數(shù)生長期的Sf9昆蟲細(xì)胞，27℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h后，去除轉(zhuǎn)染液加入2 mL SF900 Ⅲ完全培養(yǎng)基（含10%FBS）。72 h后收集上清作為第1代重組病毒，經(jīng)3次傳代得到高效價(jià)的重組桿狀病毒為種毒株。

1.7 重組SjHSP70蛋白的檢測

1.7.1 間 接 免疫熒光（Indirect Immunofluorescent Assay，IFA）檢測 用上述重組桿狀病毒毒株于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中感染Sf9細(xì)胞48 h，-20℃甲醇固定20 min。以原核表達(dá)的SjHSP70蛋白免疫BALB/c小鼠制備的血清一抗 37℃孵育 1 h ，PBST 洗滌 5 次，Alexa Fluor@488 goat anti-mouse IgG（H+L） 二 抗 孵 育45 min，PBST洗滌5次，熒光顯微鏡下觀察熒光反應(yīng)。

1.7.2SjHSP70蛋白的純化及純化蛋白的Western blot分析 重組桿狀病毒毒株大量轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，263×g離心 10 min，取沉淀，加入昆蟲細(xì)胞裂解液，室溫裂解10 min，725×g離心10 min，取上清。按照Ni-NTA His-Bind純化操作手冊(cè)純化目的蛋白，將純化的SjHSP70重組蛋白SDSPAGE電泳,轉(zhuǎn)膜封閉過夜。以感染日本血吸蟲42 d的小鼠陽性血清作一抗，室溫孵育3 h，PBST洗滌5 次，ODYSSEY anti-Mouse IRDye 800CW 作二抗，室溫孵育45 min，PBST洗滌5次，雙色紅外激光成像儀成像。

2 結(jié)果

2.1 pFastBacHTA-SjHSP70轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建以日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫為模板，PCR 擴(kuò)增出一條大小約為1962 bp的目的條帶，與預(yù)期基因大小一致（圖1）；將其與pFastBacHTA載體連接轉(zhuǎn)化，經(jīng)菌液PCR、雙酶切（圖1）及測序簽定pFastBacHTA-SjHSP70重組載體構(gòu)建成功。

圖1 SjHSP70基因的PCR擴(kuò)增（A）和pFastBacHTASjHSP70轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建及雙酶切鑒定Fig.1 The amplifi cation of SjHSP70 gene by PCR and the restriction enzyme analysis of recombinant transferring vector pFastBacHTA-SjHSP70

2.2 重組穿梭質(zhì)粒 reBacmid-SjHSP70的構(gòu)建將重組的pFastBacHTA-SjHSP70轉(zhuǎn)化至DH10Bac細(xì)胞，獲得重組穿梭質(zhì)粒reBacmid-SjHSP70。以reBacmid-SjHSP70為模板，用SjHSP70基因特異性引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1962 bp，用Bac-To-Bac桿狀病毒載體通用引物，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為4392 bp，其中2430 bp為桿狀病毒序列（圖2），表明重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 重組穿梭質(zhì)粒reBacmid-SjHSP70的PCR鑒定Fig.2 Identifi cation of recombinant bacubvirus reBacmid-SjHSP70 by PCR

2.3 間接免疫熒光（IFA）檢測SjHSP70蛋白在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)用原核表達(dá)的SjHSP70蛋白免疫BALB/c小鼠制備的血清做一抗，IFA檢測SjHSP70蛋白在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，reBacmid-SjHSP70重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞能產(chǎn)生特異性的綠色熒光，而pFastBacHTA空載體感染Sf9細(xì)胞未出現(xiàn)熒光反應(yīng)（圖3），說明SjHSP70蛋白在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。

圖3 IFA分析SjHSP70在Sf9細(xì)胞中表達(dá)（×200）Fig.3 The expression of SjHSP70 by IFA in Sf9 cells

2.4 SjHSP70蛋白的純化將His柱純化的SjHSP70重組蛋白SDS-PAGE電泳，可見一條大小約為72 kDa的單一條帶（圖4），分子量與預(yù)期大小相符。轉(zhuǎn)染12個(gè)75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶Sf9細(xì)胞可得到約800μg純度較高的蛋白。

圖4 SDS-PAGE電泳分析SjHSP70蛋白的純化Fig.4 Identifi cation of Purifi ed SjHSP70 protein by SDS-PAGE analysis

2.5 純化蛋白的Western blot分析純化的SjHSP70蛋白SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜封閉。以感染日本血吸蟲42 d的小鼠陽性血清作一抗，Western blot結(jié)果顯示大小約為72 kDa的單一條帶（圖5），表明在Sf9細(xì)胞中表達(dá)的SjHSP70蛋白可被日本血吸蟲感染的鼠的陽性血清識(shí)別，具有較好的免疫原性。

圖5 Western blot分析SjHSP70蛋白的免疫原性Fig.5 Immunogenicity analysis of SjHSP70 by Western blot

3 討論

對(duì)細(xì)菌、真菌、原蟲和哺乳動(dòng)物等物種的熱休克蛋白進(jìn)行的大量研究顯示[9,10]，熱休克蛋白70（HSP70）是一類結(jié)構(gòu)十分保守的分子，一般由3個(gè)功能上不同的結(jié)構(gòu)域所構(gòu)成，即N-端ATP酶結(jié)構(gòu)域、肽結(jié)合結(jié)構(gòu)以及C-端結(jié)構(gòu)域[11]。HSP70具有多種生物學(xué)功能，除作為分子伴侶參加蛋白分子的折疊和去折疊功能外[11]，還具有激活先天免疫系統(tǒng)（包括巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的活化以及樹突細(xì)胞的活化與成熟等）、參與抗原提呈和交叉提呈以及自身免疫和抗腫瘤免疫等功能[12]。特別是在各種應(yīng)急條件（如環(huán)境的紫外輻照、病理的感染等）刺激下出現(xiàn)在胞外的HSP70分子，在活化先天免疫系統(tǒng)中起到十分重要的作用，HSP70分子既可以像“危險(xiǎn)”信號(hào)一樣直接刺激先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，又可以通過與其結(jié)合的所謂的“伴侶肽”形成的復(fù)合物來增強(qiáng)伴侶肽抗原被APC（如巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）的處理和提呈能力[13]。

日本血吸蟲的SjHSP70分子是否也具有活化宿主樹突細(xì)胞和增強(qiáng)其伴侶肽被DC處理及提呈的功能，從而在RA血吸蟲疫苗中發(fā)揮了重要作用，有待我們進(jìn)一步驗(yàn)證。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，來源于細(xì)菌的脂多糖可通過TLR2或TLR4等信號(hào)受體介導(dǎo)的途徑激活宿主的DC形成Th1應(yīng)答環(huán)境[14]，這與已報(bào)道的一些細(xì)菌和原蟲的HSP70誘生的免疫應(yīng)答的功能和機(jī)制相類似[15]。因此，為排除脂多糖的干擾，最好采用真核表達(dá)的SjHSP70為材料來開展相關(guān)的工作。在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了含SjHSP70的真核表達(dá)載體，在昆蟲細(xì)胞Sf9中成功表達(dá)了SjHSP70分子。我們用分離純化的蛋白進(jìn)行了Western blot分析，確定了表達(dá)的蛋白具有較好的抗原性。另外，我們發(fā)現(xiàn)，用該系統(tǒng)表達(dá)的目的蛋白經(jīng)純化后的得率相對(duì)較高，可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，而用該系統(tǒng)表達(dá)的蜱來源的某些蛋白的得率很低[16]，這可能與目的蛋白的理化特性有關(guān)。采用本實(shí)驗(yàn)得到的重組SjHSP70刺激小鼠DC成熟的研究正在進(jìn)行中。

總之，本研究在真核細(xì)胞Sf9中成功表達(dá)了SjHSP70，同時(shí)純化和鑒定了重組蛋白，為進(jìn)一步研究SjHSP70活化宿主DC等免疫學(xué)功能提供了材料。

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