藍(lán)莓不可萃取多酚的酸法提取工藝優(yōu)化

韓彩靜, 謝春陽, 陳相艷, 王文亮, 程安瑋,*, 弓志青, 石賢權(quán)

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所,山東濟(jì)南 250100;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長春 130118)

藍(lán)莓(Vaccinium corymbosum L.)屬于杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)植物.營養(yǎng)豐富,被稱為“水果皇后”.藍(lán)莓果實(shí)中除了常規(guī)的糖、酸和Vc外,還富含 VE、VA、VB、SOD、熊果苷、蛋白質(zhì)、花青苷、食用纖維以及豐富的 K、Fe、Zn、Ca等元素.藍(lán)莓亦含有大量有利于視網(wǎng)膜的花青素,因此藍(lán)莓又被稱為“美瞳之果”.

多酚類化合物是指分子結(jié)構(gòu)中有若干個(gè)酚性羥基的植物成分的總稱,包括黃酮類、單寧類、酚酸類以及花色苷類等.根據(jù)多酚結(jié)合方式和萃取方法的不同,將其分為可萃取多酚(extractable polyphenols,EPP)和不可萃取多酚(non-extractable polyphenols,NEPP).可萃取多酚主要是指通過簡單的有機(jī)溶劑萃取或水就可以獲得的處于游離狀態(tài)的多酚,而不可萃取多酚主要是指結(jié)合于細(xì)胞壁上的一些水合單寧酸和原花青素,需通過化學(xué)或者酶處理方法,打破多酚物質(zhì)與細(xì)胞壁結(jié)合的化學(xué)鍵,才將其分離出來的部分[1].總多酚(total polyphenols,TPP)是指EPP和NEPP的加和[2].雖然有關(guān)NEPP早在1973年就有研究,但由于缺乏合適的分析研究方法,一直沒有引起人們的注意[3].最近Arranz等[1]研究指出,NEPP需要用酸加熱,將其從細(xì)胞壁分離,然后再萃取.Matthews等[4]也指出可以從殘?jiān)杏昧蛩崴獾姆椒?分離制備不可萃取原花青素.Madhujith等[5]采用堿水解的方法研究了大麥中的EPP和NEPP.但這些研究者僅簡單指出用酸或者堿水解的方式,對具體的提取分離參數(shù)沒有相關(guān)的研究.此外,近來有關(guān)多酚提取純化及抗氧化活性研究的文獻(xiàn)很多,但基本上是集中在可萃取部分[6-10].

本實(shí)驗(yàn)以藍(lán)莓為原料,首先除去可萃取部分,然后采用酸水解的方法,對萃取溶劑種類、萃取溶劑濃度、萃取溫度、時(shí)間、料液比等參數(shù)進(jìn)行了研究,并進(jìn)一步采用響應(yīng)面法對各個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳酸法提取工藝.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮速凍藍(lán)莓,從濟(jì)南市場購買,進(jìn)口商品,品牌為Midgold.室溫解凍后用打漿機(jī)打漿.2 mol/L福林酚試劑和標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸(gallic acid),色譜純,美國 Sigma公司;乙醇、濃 H2SO4、甲醇、Na2CO3均為分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

組織勻漿機(jī),飛利浦公司;超聲波清洗機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;高速萬能粉粹機(jī),北京市永光明醫(yī)療儀器廠;UV160型紫外分光光度計(jì),日本島津;水浴鍋,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;電熱恒溫干燥箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;電子天平,奧豪斯儀器(上海)有限公司;離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 多酚萃取率的測定

采用福林-酚法測定多酚含量[11].取100 μL萃取液,加2 mL蒸餾水和200 μL福林-酚試劑混勻,然后加900 μL 20%質(zhì)量濃度的Na2CO3,混勻,在暗處存放2 h,測定765 nm處吸光度值.以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.003x+0.029,R2=0.999 2,其中y表示吸光度;x表示多酚濃度,單位μg/mL.

1.3.2 去除可萃取多酚

將新鮮藍(lán)莓果打碎成漿,按料液比(質(zhì)量濃度,g/mL)1∶2.5加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇萃取液,常溫下200 W超聲提取1 h,取出后4 000 r/min離心15 min,分離上清液和沉淀.在沉淀中重新加入50%乙醇,重復(fù)一次,留濾渣備用.將濾渣50℃烘干,粉粹機(jī)打成細(xì)粉.細(xì)粉即為去除EPP藍(lán)莓粉,作為實(shí)驗(yàn)材料.

1.3.3 NEPP提取的單因素實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)時(shí),取0.2 g物料,按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件,進(jìn)行操作萃取,對萃取液稀釋10倍后,測定吸光度,結(jié)果根據(jù)1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出NEPP質(zhì)量濃度(μg/mL),然后按照稀釋倍數(shù)、萃取液體積與被萃取的物料質(zhì)量,計(jì)算出萃取得到的NEPP質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g),即溶劑對去除EPP藍(lán)莓粉的NEPP萃取率,以此作為衡量酸法提取NEPP工藝效果的指標(biāo).實(shí)驗(yàn)均平行操作3次,取平均值.設(shè)定了料液比、溫度、時(shí)間、萃取液濃度、萃取液種類等5個(gè)單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取較優(yōu)的因素和水平,采用響應(yīng)面分析方法對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化.根據(jù)Box-Benhnken原理,選取影響NEPP萃取率的合適因素和水平,進(jìn)行響應(yīng)面分析優(yōu)化.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 萃取液種類和濃度對NEPP萃取率的影響

固定料液比(質(zhì)量濃度,g/mL)1∶20,溫度70℃,加熱時(shí)間10 h,研究萃取液種類(乙醇/硫酸和甲醇/硫酸)及萃取液濃度(體積比為90/10,95/5,97/3)對藍(lán)莓粉中NEPP萃取率的影響,結(jié)果見圖1.

圖1 萃取液種類和濃度對NEPP萃取率的影響Fig.1 Effect of extracted solution and concentration on NEPP yield

從圖1可以看出,甲醇/硫酸的萃取效果要優(yōu)于乙醇/硫酸,因此在下一步實(shí)驗(yàn)中固定選取甲醇/硫酸作為萃取溶劑.由于甲醇/硫酸的體積比對NEPP的萃取率影響不大,下一步實(shí)驗(yàn)中固定甲醇/硫酸體積比為90/10.因此在響應(yīng)面分析中萃取液種類和萃取液濃度這2個(gè)參數(shù)不作為考察因素.

2.1.2 料液比對NEPP萃取率的影響

圖2 料液比對NEPP萃取率的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on NEPP yield

固定萃取溶劑為甲醇/硫酸(90/10,體積比),溫度70℃,加熱時(shí)間10 h,選擇不同的料液比(質(zhì)量濃度,g/mL)1∶5,1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,研究料液比對NEPP萃取率的影響,結(jié)果見圖2.

由圖2可以看出,在料液比(質(zhì)量濃度,g/mL)1∶5至1∶15范圍內(nèi)NEPP的萃取率明顯升高,而在1∶15至1∶25范圍內(nèi),NEPP的提取有上升的趨勢,但是差別不大.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們選擇料液比(質(zhì)量濃度,g/mL)1∶15,1∶10,1∶25這3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面分析.

2.1.3 萃取溫度對NEPP萃取率的影響

固定萃取溶劑為甲醇/硫酸(90/10,體積比),料液比(質(zhì)量濃度,g/mL)1∶20,加熱時(shí)間10 h,選擇不同的加熱溫度50,60,70,80,90℃,研究加熱溫度對NEPP萃取率的影響,結(jié)果見圖3.

圖3 萃取溫度對NEPP萃取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on NEPP yield

從圖3可以看出,NEPP的萃取率隨著溫度的升高而升高,90℃時(shí)提取效果最好.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們選擇萃取溫度70,80,90℃3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面分析.

2.1.4 萃取時(shí)間對NEPP萃取率的影響

固定萃取溶劑為甲醇/硫酸(90/10,體積比),料液比(質(zhì)量濃度,g/mL)1∶20,溫度70℃,研究加熱時(shí)間10,15,20,25 h對NEPP萃取率的影響,結(jié)果見圖4.

圖4 萃取時(shí)間對NEPP萃取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on NEPP yield

由圖4可以看出,當(dāng)加熱時(shí)間為20 h時(shí),NEPP的萃取率達(dá)到最大,隨著加熱時(shí)間的繼續(xù)延長,NEPP的萃取率基本沒有變化.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇加熱時(shí)間15,20,25 h 3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面分析.

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對工藝參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合單因素實(shí)驗(yàn),選取對NEPP萃取率影響較大的時(shí)間、溫度、料液比3個(gè)因素,確定了相應(yīng)的3個(gè)水平,見表1.進(jìn)行響應(yīng)面分析方法,確定NEPP的最優(yōu)提取方法,見表2和圖5.并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析,得到如下回歸方程和方差分析結(jié)果,見表3.

表1 響應(yīng)面分析因素水平表Tab.1 Factors and levels in response surface analysis

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Tab.2 Analysis results of response surface methodology

用響應(yīng)面軟件分析得出NEPP萃取率的回歸方程為

式中X1為溫度,X2為時(shí)間,X3為料液比,Y為NEPP萃取率.

表3 回歸方程方差分析Tab.3 Analysis and statistical parameters of regression model

由表3可得出,除了溫度和料液比的交互作用不顯著外,其他項(xiàng)都顯著.失擬項(xiàng)不顯著,表明方程對實(shí)驗(yàn)得擬合程度很好,相關(guān)系數(shù)R2=0.993 5,表明99.35%的數(shù)據(jù)可以用此方程解釋[12].綜合上述,此方程能很好的分析和預(yù)測所建模型,模擬真實(shí)的3因素3水平分析可行.各因素的影響程度從大到小依次為溫度、時(shí)間、料液比.溫度的影響最大,P值小于0.000 1,其次為時(shí)間P值0.000 4,料液比P值為0.000 5,溫度和料液比的交互作用不顯著P值大于0.05.

2.2.2 響應(yīng)面圖分析

從圖5a可以看出,溫度的變化曲面較陡,說明溫度對NEPP萃取率的影響較大,隨著溫度的升高NEPP萃取率先高后低,在80℃左右達(dá)到最大值.時(shí)間的變化曲面較緩,說明時(shí)間對NEPP萃取率的影響相對較小.從等高線曲線可以看出,沿溫度軸向等高線密集,而時(shí)間軸向等高線相對稀疏,說明溫度對NEPP萃取率的響應(yīng)值較時(shí)間影響大.等高線呈橢圓形,說明溫度和時(shí)間的交互作用強(qiáng),影響顯著[13-15].

從圖5b可以看出,料液比、溫度都是先增后降,料液比(質(zhì)量濃度,g/mL)1∶20左右達(dá)到最大值,溫度在80℃左右達(dá)到最大值.從等高線圖可以看出,溫度軸向的等高線密集,說明溫度對NEPP萃取率的響應(yīng)值影響大,料液比軸向的等高線相對稀疏,說明料液比對NEPP萃取率的響應(yīng)值比溫度影響小[16].

從圖5c可以看出,料液比的變化曲面和時(shí)間的變化曲面都比較陡峭,說明這兩者對NEPP萃取率影響都較大.兩者的交互作用成橢圓,說明兩者的交互作用強(qiáng),這與方差分析結(jié)果一致.從等高線圖來看,時(shí)間軸向等高線密集,料液比軸向的等高線較時(shí)間軸向相對稀疏,說明時(shí)間影響相對較大,這與方差分析結(jié)果一致.

2.2.3 最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證回歸模型的可靠性,以響應(yīng)面得到的最佳數(shù)值進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),溫度為73.88℃,時(shí)間為22.67 h,料液比(質(zhì)量濃度,g/mL)為1∶20.62,預(yù)計(jì)值為26.19 mg/g.在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中取了該最佳條件的相似條件,溫度取74℃,時(shí)間取22.5 h,料液比(質(zhì)量濃度,g/mL)取1∶21進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),NEPP在不含EPP藍(lán)莓粉的萃取率為27.25 mg/g,和預(yù)測值很相近,證明最佳實(shí)驗(yàn)條件最優(yōu).

3 結(jié) 論

通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了藍(lán)莓NEPP提取的萃取溶劑及濃度為甲醇/硫酸(90/10,體積比),溫度為70～90℃,時(shí)間為15～25 h,料液比(質(zhì)量濃度,g/mL)為1∶15 ～1∶20.

圖5 溫度、時(shí)間、料液比對NEPP萃取率的影響Fig.5 NEPP as affetcted by temperature,time and soid/liquid ratio

通過料液比、萃取溫度、時(shí)間這3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析,建立NEPP萃取率的回歸方程,結(jié)果表明這3個(gè)因素都對NEPP萃取率影響顯著,影響順序由大到小依次為溫度,時(shí)間,料液比.R2=0.993 5,模型擬合度好.通過響應(yīng)面分析確定出的最佳提取條件為溫度74℃,時(shí)間22.5 h,料液比(質(zhì)量濃度,g/mL)1∶21,在該條件下通過實(shí)驗(yàn)不含EPP藍(lán)莓粉中NEPP萃取率達(dá)27.25 mg/g.

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