董耀華，郭娜，劉濤

(上海海事大學(xué)a.海洋材料科學(xué)與工程研究院;b.商船學(xué)院，上海 201306)

0 引言

因為納米銀對微生物有強烈的抑制和殺滅作用，而且不會產(chǎn)生耐藥性，越來越受到研究者的關(guān)注.但目前，國內(nèi)外關(guān)于納米銀的抑菌機理仍存在很大爭議.PHILLIPS 對陽離子聚合物包覆的納米銀顆粒進行研究，實驗結(jié)果表明陽離子納米顆粒更易與革蘭氏陰性菌(如大腸埃希氏菌)表面帶負電的脂多糖層接近，因此對革蘭氏陰性菌的作用更明顯［1］;CAI 等［2］證明單獨的介孔氧化硅顆粒對微生物生長無抑制作用，從一個側(cè)面證明納米銀的抑菌性;LIONG 等［3］發(fā)現(xiàn)納米銀與微生物之間的作用與表面性質(zhì)和細胞毒性有關(guān);MIGNOT 等［4］研究表明，革蘭氏陽性菌表面肽聚糖層有帶負電的磷壁酸，它產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)狀結(jié)晶S-層，從而環(huán)繞在細胞周圍，影響細菌與納米顆粒的交互反應(yīng);MORONES等［5］認為納米銀在溶液中之所以具有比銀離子更高的抑菌性，是因為銀顆粒自身的毒性、納米尺寸效應(yīng)及銀離子的可調(diào)釋放性.

為了進一步探討納米銀的抑菌機理，分別利用納米銀、載銀介孔氧化硅、納米銀和納米鐵的混合物等3 種粉體開展抑菌實驗研究.

1 試樣的制備

1.1 試樣制備

將20 g 硝酸銀加入850 mL 二甲苯中，加入油胺100 mL，在氮氣保護下不斷攪拌，并緩慢升溫到140 ℃，待溶液顏色逐漸變深并出現(xiàn)藍色漂浮物后，繼續(xù)維持140 ℃達12 h，然后加入500 mL 乙醇稀釋，以3 500 r/min 速率離心10 min，濾掉上層清液.沉淀物用乙醇再洗滌3 次，干燥后得到12 g 呈亮藍色的納米銀.

取2 g 納米銀與納米鐵粉1∶1均勻混合;基于納米銀不溶于水、乙醇和丙酮等溶劑，但能溶解于二甲苯、氯仿等溶劑的特點，將5 g 納米銀溶解于氯仿中，并與熱的氫氧化鈉溶液混合，之后加入造孔劑，利用超聲使之均勻混合，蒸發(fā)掉氯仿后，經(jīng)過高速離心去除沉淀與雜質(zhì)，把上清液配成水溶液加熱，并加入硅源混合攪拌，然后依次離心分離，乙醇清洗，最后利用有機溶劑去除活性劑，打開孔道，得到39 g載銀介孔氧化硅顆粒.

1.2 培養(yǎng)基制備

實驗采用需納弧菌(Vibrio natriegens)為實驗菌種.將15 g 瓊脂、5 g 蛋白胨、10 mg FePO4和1 mL酵母汁溶解在1 L 天然海水中，用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)至pH 值為7.2～7.4，然后裝入三角瓶中封口，并在120 ℃高壓滅菌20 min，冷卻后待用.

2 實驗方法

為有效區(qū)分納米銀與銀離子的抑菌效果，添加納米鐵粉以阻止納米銀過早被氧化成銀離子;而利用多孔氧化硅包覆納米銀的目的是測試納米銀的釋放速率與抑菌效果的關(guān)系.實驗中，納米銀粉體和載銀介孔氧化硅粉體的微觀形貌和電子能譜采用JSM7500F 型掃描電鏡觀察和分析.載銀介孔氧化硅粉體中納米銀的存在形式通過JEM2100F 型透射電鏡分析.抑菌實驗中，通過對需納弧菌的抑菌圈實驗和生長曲線的測定研究討論納米銀的抑菌機理.

在抑菌實驗中，為減少因納米顆粒本身帶的電荷、溶液的表面張力、顆粒與濾紙間的相互作用等因素對納米顆粒在濾紙上吸附量的影響，先將濾紙剪成4 張直徑為20 mm 的圓片，經(jīng)紫外照射滅菌后待用，并將0.05 mg/L 納米銀溶液(S2)、0.39 mg/L 載銀介孔氧化硅溶液(S3)和0.1 mg/L 納米鐵和納米銀混合溶液(S4)分別同時采用超聲30 min，使溶液顆粒分散均勻，然后使用移液槍分別取等量(0.1 mL)的上述3 種溶液，緩慢滴入3 張濾紙圓片上，并在無菌操作臺上靜置干燥，最后一張作為空白樣(S1)，一起開紫外燈照射15 min 滅菌.待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右倒入4個無菌培養(yǎng)皿中適量，水平放置待凝固.然后用滅菌后的移液管吸取0.1 mL濃度為5%的菌液滴加到培養(yǎng)基平板中，用無菌三角涂棒涂抹均勻.再用無菌鑷子將上述已滅菌的4 種樣品輕輕貼在有菌培養(yǎng)基中心，最后將上述培養(yǎng)皿放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，72 h 后取出，觀察其抑菌圈情況并測量抑菌圈的尺寸.

在生長曲線測定中，按10%體積比接種富集培養(yǎng)需納弧菌，以無菌玻璃棒攪拌均勻后放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，48 h 后取出，按200 mL/瓶分裝在3個滅菌后的三角瓶中.一瓶不作處理，一瓶放入5 μg納米銀，一瓶放入39 μg 載銀介孔氧化硅，搖勻后再次放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，并開始不定時采用比濁法檢測3個瓶中菌的生長情況.

3 實驗結(jié)果和討論

3.1 微觀形貌

如圖1 所示，從樣品掃描照片可以看出，根據(jù)上述方案制備的納米銀粒徑大小在12～20 nm 之間.圖2為載銀介孔氧化硅粉體的微觀形貌，介孔氧化硅中心負載有納米銀顆粒，而且分布非常均勻，通過透射電鏡圖(圖3)可以得到氧化硅和納米銀的直徑分別為50 nm和10 nm 左右.根據(jù)該樣品的電子能譜也能證明納米顆粒中硅、銀、氧的存在，如圖4 所示，根據(jù)多次電子能譜結(jié)果可以同時計算出實驗所制備的載銀介孔氧化硅中納米銀的含量約為12.77%.

3.2 抑菌實驗分析

圖5為空白樣品、納米銀樣品、載銀介孔氧化硅樣品、納米銀和納米鐵粉混合樣品的抑菌實驗結(jié)果.從實驗結(jié)果可以看出，空白樣幾乎沒有抑菌圈(圖5(a))，納米銀樣品的抑菌圈(圖5(b))最大，清晰可見，約為4.3 cm，而載銀介孔氧化硅樣品的抑菌圈(圖5(c))最小，為2.3 cm，且明顯小于納米銀與納米鐵粉混合粉體樣品的抑菌圈(2.6 cm，圖5(d)).可見，在納米鐵粉或介孔氧化硅的作用下，納米銀的抑菌效果受到限制.事實上，暴露在空氣或液體環(huán)境中的金屬銀單質(zhì)容易被逐步氧化，原來的Ag0逐步被轉(zhuǎn)變成Ag+［6］，根據(jù)文獻［7］和［8］的相關(guān)研究，Ag+可與細菌體內(nèi)生物酶中有關(guān)的巰基結(jié)合，破壞細菌控制呼吸的基因鏈，使之不能產(chǎn)生活性氧(ROS).結(jié)合上述理論分析，在本實驗中納米銀樣品的抑菌圈最大，這是因為隨著在液體環(huán)境中浸泡時間的延長，納米銀開始以Ag+的形式快速持續(xù)釋放到周圍環(huán)境中，從而產(chǎn)生明顯的抑菌效果，但在納米鐵粉或介孔氧化硅的作用下，納米銀受到保護和包裹作用，使得納米銀顆粒的被氧化速率受到抑制，其抑菌效果被限制并減弱.因此可以判斷，納米銀氧化速度的快慢直接影響其抑菌效果.

圖5 抑菌圈實驗

3.3 生長曲線分析

比濁法［9］是指由于微生物的生長引起培養(yǎng)物混濁度的增高，通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值，就可以判斷微生物的生長狀況.一般選擇在波長550 nm 處用比色管定時測定發(fā)酵液的吸光光度值OD550，可以監(jiān)控菌類的生長數(shù)量以繪制生長曲線［10］.添加不同樣品后的培養(yǎng)基中需納弧菌生長曲線見圖6.可見，0～2 d 內(nèi)，空白樣中的需納弧菌快速生長，添加納米銀樣品的培養(yǎng)基中的需納弧菌因受到抑制而迅速減少，減少速率明顯快于添加載銀介孔氧化硅樣品的細菌變化速率，這可能因為實驗開始時，納米銀被液相中的溶解氧氧化，迅速釋放，使得抑菌效果明顯.載銀介孔氧化硅因為受到二氧化硅的包覆，與周圍環(huán)境的接觸面積明顯減少，使得納米銀的氧化和釋放效率變低，并在實驗開始的2 h 內(nèi)，需納弧菌有增多趨勢.實驗的第3 天，空白樣中的需納弧菌生長達到平衡，之后因為培養(yǎng)基慢慢被消耗，細菌開始減少.添加納米銀樣品的培養(yǎng)基則在第5 天明顯出現(xiàn)需納弧菌的繁殖，這說明納米銀已經(jīng)完全釋放而失效，抑菌能力喪失，細菌數(shù)量增長使得OD550 數(shù)值再度上升.而在添加載銀介孔氧化硅樣品的培養(yǎng)基中，由于納米銀的釋放速度較慢，隨著納米銀被氧化成銀離子，其抑菌效果逐漸顯現(xiàn)，從第3 天開始就始終維持較為穩(wěn)定的OD550 數(shù)值，說明此時瓶中的需納弧菌持續(xù)受到納米銀的抑制和殺滅作用，始終難以正常繁殖和生長.由此可見，納米銀的釋放速度和氧化效率也是納米銀抑菌的關(guān)鍵因素，在一定濃度內(nèi)，釋放速度或氧化速度越快，抑菌效果越早顯現(xiàn)，但從長期抑菌效果看，納米銀的過快氧化不利于其防污效果的持久性.

圖6 生長曲線

4 結(jié)束語

通過抑菌實驗和生長曲線測定結(jié)果，納米銀抑菌機理在于其銀離子的釋放，大量銀離子來自于零價納米銀顆粒被氧化，在一定時間內(nèi)，氧化速度與抑菌效果成正比.當納米銀溶液中摻雜納米鐵粉后，由于零價鐵比零價銀更活潑，所以銀的氧化反應(yīng)受到抑制，其抑菌圈直徑小于單純納米銀;同樣，當納米銀被多孔二氧化硅包覆時，由于二氧化硅阻礙銀與液相中溶解氧的接觸，其氧化速度也大大降低，但其抑菌長效性會在實驗后期逐漸顯現(xiàn).

［1］SAHA S，LEUNG K C F，NGUYEN T D，et al.Nanovalves［J］.Adv Funct Mater 2007，17(5):685-693.

［2］CAI Qiang，LUO Zhongsheng，PANG Wenqin，et al.Dilute solution routes to various controllable morphologies of MCM-41 Silica with a basic medium［J］.Chem Mater，2001，13(2):258-263.

［3］LIONG M，LU J，KOVOCHICH M，et al.Multifunctional inorganic nanoparticles for imaging，targeting，and drug delivery［J］.ACS Nano，2008，2(5):889-896.

［4］MIGNOT T，DENIS B，COUTURE-TOSI E，et al.Distribution of S-layers on the surface of Bacillus cereus strains:phylogenetic origin and ecological pressure［J］.Environ Microbiol，2001，3(8):493-501.

［5］MORONES J R，ELECHIGUERRA J L，CAMACHO A，et al.The bactericidal effect of silver nanoparticles［J］.Nanotechnology，2005，16(10):2346-2353.

［6］DONG Baiyan，MANOLACHE S，SOMERS E B，et al.Generation of antifouling layers on stainless steel surfaces by plasma-enhanced crosslinking of polyethylene glycol［J］.Appl Polym Sci，2005，97(2):485-497.

［7］MATSUMURA Y，YOSHIKATA K，KUNISAKI S，et al.Mode of bactericidal action of silver zeolite and its comparison with that of silver nitrate［J］.Appl Environ Microbiol，2003，69(7):4278.

［8］ASHARANI P V，MUN G L K，HANDE M P.Cytotoxicity and genotoxicity of silver nanoparticles in human cells［J］.ACS Nano，2009，3(2):279-290.

［9］LI W W，ZHOU W Z，ZHANG Y Z，et al.Flocculation behavior and mechanism of an exopolysaccharide from the deep sea psychrophilic bacterium Pseudoalteromonas sp［J］.Bioresource Technol，2008，99(15):6893-6899.

［10］COYER J A，CABELLO-PASINI A，SWIFT H，et al.N2fixation in marine heterotrophic bacteria:dynamics of environmental and molecular regulation［J］.Proc Natl Acad Sci，1996，93(8):3575-3580.