瞿 亮，任路靜，黃 和

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009）

裂殖壺菌發(fā)酵產(chǎn)DHA過程呼吸參數(shù)的在線檢測(cè)分析

瞿 亮，任路靜，黃 和

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009）

利用尾氣分析儀對(duì)發(fā)酵過程的尾氣中的O2、CO2含量進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，建立了裂殖弧菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA過程中的呼吸參數(shù)在線檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了裂殖壺菌補(bǔ)料分批發(fā)酵過程及雙階段供氧控制發(fā)酵過程中的呼吸參數(shù)在線檢測(cè)分析。通過呼吸參數(shù)在線檢測(cè)分析，從氧消耗機(jī)制方面解釋了雙階段氧傳遞控制工藝能獲得較高生物量、油脂和DHA含量的原因，從而為該工藝過程提供了理論指導(dǎo)。根據(jù)發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)不同時(shí)期的呼吸參數(shù)的變化情況，建立了基于呼吸商變化的在線補(bǔ)料控制方法，設(shè)計(jì)了一種基于RQ?Stat的補(bǔ)料工藝。RQ?Stat補(bǔ)料方式最終獲得的油脂含量、DHA產(chǎn)量和產(chǎn)率比間歇式補(bǔ)料工藝分別提高了11.58%、12.19%和11.40%。

DHA；裂殖壺菌；補(bǔ)料工藝；呼吸參數(shù)

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA），是一種重要的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，由于其對(duì)嬰幼兒和成人健康方面的益處而受到廣泛的關(guān)注［1］。裂殖壺菌，作為一種海洋真菌，具有合成大量富含DHA的微生物油脂的能力，是生產(chǎn)DHA的理想菌種［2］。一些研究表明O2供應(yīng)條件對(duì)裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA過程中的細(xì)胞生長(zhǎng)和DHA合成有顯著的影響［3-6］。

呼吸商（respiratory quotient，RQ），是指生物體在同一時(shí)間內(nèi)呼吸作用所釋放的CO2和吸收的O2的分子比，是反映微生物菌體細(xì)胞活力和生理特性的一個(gè)重要參數(shù)，一般可以通過尾氣分析計(jì)算得到。微生物發(fā)酵過程中呼吸商的在線監(jiān)測(cè)可以反映菌體對(duì)有關(guān)基質(zhì)代謝情況的信息及發(fā)酵過程供氧及O2消耗情況，目前已成功運(yùn)用在好氧微生物發(fā)酵過程的變量補(bǔ)料控制和測(cè)量方面［7］。

筆者所在課題組前期對(duì)裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA過程的供氧調(diào)控方面做了一些研究工作［5-6］。本文中從裂殖壺菌發(fā)酵產(chǎn)DHA過程的呼吸參數(shù)角度進(jìn)行研究，利用尾氣分析儀對(duì)發(fā)酵過程的尾氣中的O2、CO2含量進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)補(bǔ)料分批發(fā)酵過程及雙階段補(bǔ)料分批發(fā)酵過程的各個(gè)時(shí)期的呼吸參數(shù)的在線監(jiān)測(cè)分析，并且在此基礎(chǔ)上開發(fā)一種基于呼吸商在線檢測(cè)的RQ?Stat補(bǔ)料工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

裂殖壺菌（Schizochytrium sp.）CCTCCM209059，從海水中分離篩選獲得，保藏在中國(guó)典型微生物培養(yǎng)中心（CCTCC）。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)基組成和種子培養(yǎng)條件參照文獻(xiàn)［8］。補(bǔ)料分批發(fā)酵在裝有7 L發(fā)酵培養(yǎng)基的10 L發(fā)酵罐中進(jìn)行，25℃恒溫培養(yǎng)，其他發(fā)酵條件參照文獻(xiàn)［6］。

1.2 分析檢測(cè)方法

葡萄糖、谷氨酸、細(xì)胞干質(zhì)量、脂質(zhì)提取和脂肪酸甲酯化方法參照文獻(xiàn)［8］。氣相色譜（GC）分析脂肪酸組成并且用十九烷酸甲酯（C19∶0甲酯）作為內(nèi)標(biāo)定量測(cè)定DHA的含量［9］。發(fā)酵罐尾氣中的O2和CO2含量采用尾氣分析儀（Megellan Instruments公司，Tandem Multiplex）檢測(cè)。

1.3 呼吸參數(shù)在線檢測(cè)方法

利用尾氣分析儀，實(shí)時(shí)檢測(cè)發(fā)酵過程中尾氣的O2含量，并根據(jù)進(jìn)入發(fā)酵液的空氣體積流量，發(fā)酵液體積等參數(shù)，利用式（1）即可計(jì)算出氧利用速率（vO）。

式中：Fɑ，i為進(jìn)入發(fā)酵液的空氣在標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的體積流量（m3／h）；V為發(fā)酵液體積，m3；φ（CO2）i為進(jìn)入發(fā)酵液的空氣中O2的體積分?jǐn)?shù)；φ（CO2）o為排出發(fā)酵液的空氣中的O2體積分?jǐn)?shù)。

同O2消耗速率一樣，利用尾氣分析儀，實(shí)時(shí)檢測(cè)發(fā)酵過程中尾氣的CO2含量，并根據(jù)進(jìn)入發(fā)酵液的空氣體積流量，發(fā)酵液體積等參數(shù)，利用式（2）即可計(jì)算出CO2釋放速率（vC）。

式中：Fɑ，i為進(jìn)入發(fā)酵液的空氣在標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的體積流量（m3／h）；V為發(fā)酵液體積，m3；φ（CO2）i為進(jìn)入發(fā)酵液的空氣中CO2的體積分?jǐn)?shù)；φ（CO2）o為排出發(fā)酵液的空氣中CO2的體積分?jǐn)?shù)。

呼吸商（RQ）由CO2釋放速率除以O(shè)2消耗速率求得。

2 結(jié)果與討論

2.1 裂殖壺菌發(fā)酵過程呼吸參數(shù)在線檢測(cè)分析

2.1.1 裂殖壺菌補(bǔ)料分批發(fā)酵過程的呼吸參數(shù)在線檢測(cè)分析

在10 L發(fā)酵罐中，進(jìn)行裂殖壺菌的補(bǔ)料分批發(fā)酵，利用尾氣分析儀對(duì)發(fā)酵過程的尾氣中的O2和CO2含量進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵過程的各個(gè)時(shí)期的呼吸參數(shù)的在線監(jiān)測(cè)。發(fā)酵結(jié)果及發(fā)酵過程的呼吸商變化情況如圖1、圖2所示。

由圖1和圖2可知：發(fā)酵初始階段，RQ不斷增加，直至大于1；在補(bǔ)加葡萄糖前后，呼吸商有個(gè)明顯變化的過程，46和70 h這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，是葡萄糖耗到0后再補(bǔ)加葡萄糖的時(shí)間，補(bǔ)加前后RQ有明顯的變化，補(bǔ)加前呼吸商在1.0以下，補(bǔ)加后RQ在1.0以上。

這是由于在葡萄糖供應(yīng)充足的條件下，菌體如果在供氧充分時(shí)利用葡萄糖，RQ為1；葡萄糖的供給大于供氧條件，則會(huì)利用葡萄糖產(chǎn)生其他代謝產(chǎn)物，RQ大于1；而葡萄糖不足的時(shí)候，菌體會(huì)利用油脂或其他成分，則RQ就會(huì)小于1。因此，在發(fā)酵過程中，如果通過調(diào)節(jié)呼吸商保持在1左右，會(huì)使得葡萄糖濃度保持在一個(gè)較低的水平，從而減少其他代謝產(chǎn)物的生成。

圖1 裂殖壺菌補(bǔ)料分批發(fā)酵過程曲線Fig.1 Time courses of DHA production in fed?batch fermentation process by Schizochytrium sp.

圖2 裂殖壺菌補(bǔ)料分批發(fā)酵過程RQ的變化Fig.2 Changes of RQ in fed?batch fermentation process by Schizochytrium sp.

2.1.2 裂殖壺菌雙階段氧傳遞控制補(bǔ)料分批發(fā)酵過程的呼吸參數(shù)在線檢測(cè)分析

裂殖壺菌的分批補(bǔ)料發(fā)酵過程中存在著生物量增長(zhǎng)和油脂積累兩個(gè)階段，這兩個(gè)階段細(xì)胞對(duì)溶解氧的需求不同，在筆者之前的研究工作中，曾經(jīng)設(shè)計(jì)了一種在生物量增長(zhǎng)階段采用較高的供氧條件，油脂積累階段將供氧水平降低的雙階段氧傳遞控制的發(fā)酵工藝［6］，本研究將采用前面建立的呼吸參數(shù)在線檢測(cè)的方法，對(duì)雙階段氧傳遞控制的發(fā)酵過程的呼吸參數(shù)進(jìn)行在線檢測(cè)分析，從而為該工藝方法提供一定的理論支持。

采用10 L發(fā)酵罐進(jìn)行裂殖壺菌的分批補(bǔ)料發(fā)酵，通過改變不同的攪拌速率，實(shí)現(xiàn)雙階段的氧傳遞控制，通過尾氣分析儀檢測(cè)發(fā)酵過程尾氣中的O2和CO2含量，實(shí)現(xiàn)對(duì)雙階段O2傳遞控制的發(fā)酵過程的呼吸參數(shù)在線檢測(cè)分析。發(fā)酵結(jié)果與發(fā)酵過程的呼吸參數(shù)情況見圖3和圖4。

圖3 裂殖壺菌雙階段氧傳遞控制補(bǔ)料分批發(fā)酵過程曲線Fig.3 Time courses of DHA production in two?stage oxygen supp ly control fed?batch fermentation p rocess by Schizochytrium sp.

圖4 裂殖壺菌雙階段氧傳遞控制補(bǔ)料分批發(fā)酵過程呼吸參數(shù)的變化Fig.4 Changes of vc，vo，and RQ in two?stage oxygen supply control fed?batch fermentation process by Schizochytrium sp.

從圖3中可以看出，采用雙階段氧傳遞工藝的補(bǔ)料分批發(fā)酵過程，最終獲得的生物量、油脂含量及DHA含量比補(bǔ)料分批發(fā)酵過程均有一定的提高，分別提高了3.06%、14.61%和11.45%。圖4中顯示的該過程的呼吸參數(shù)變化情況，說明在發(fā)酵前期，采用較高供氧條件時(shí)，發(fā)酵體系的O2消耗速率和CO2釋放速率均較高，表明在高供氧條件下，菌體的呼吸作用更加旺盛，這就有利于菌體生長(zhǎng)階段的生物量的增加，而在發(fā)酵中后期，降低了供氧條件，使得菌體的呼吸作用也降低，從而有利于油脂的積累，也有利于DHA的合成，這是由于在油脂積累階段，較高的O2供應(yīng)會(huì)導(dǎo)致更多的C源用作細(xì)胞呼吸和能量代謝，而不是用作油脂合成。因此，在油脂積累階段減少O2的供應(yīng)可以提高C源利用效率從而增加油脂積累。此外，對(duì)裂殖壺菌而言，長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸如DHA的合成是通過一種多不飽和脂肪酸合成酶途徑實(shí)現(xiàn)的，而該過程不需要分子氧的參與［10］。

2.2 基于RQ控制的裂殖壺菌分批發(fā)酵的補(bǔ)料工藝研究

根據(jù)圖2中裂殖壺菌發(fā)酵過程的RQ變化情況分析，如果在發(fā)酵過程中將RQ保持在1左右，會(huì)使得葡萄糖濃度保持在一個(gè)較低的水平，從而減少其他代謝產(chǎn)物的生成，有利于C源在裂殖壺菌體內(nèi)流向油脂和DHA合成途徑，從而有利于油脂和DHA的積累。并且2.2.2中雙階段氧傳遞控制補(bǔ)料分批發(fā)酵過程的呼吸參數(shù)分析也表明，在發(fā)酵中后期降低供氧條件也有利于油脂的積累以及DHA通過不需要O2的途徑積累，因此通過將RQ保持在1左右，可以將發(fā)酵過程氧供應(yīng)保持在較低水平，從而有利于DHA的積累。根據(jù)對(duì)裂殖壺菌發(fā)酵過程的油脂和DHA積累和合成途徑的分析以及發(fā)酵過程呼吸參數(shù)情況的分析，筆者設(shè)計(jì)了一種基于RQ在線監(jiān)測(cè)的RQ?Stat的補(bǔ)料工藝，該工藝是在發(fā)酵中期開始，當(dāng)監(jiān)測(cè)到的RQ低于1的時(shí)候，開始啟動(dòng)補(bǔ)料，以一定的速度向發(fā)酵罐內(nèi)流加一定濃度的葡萄糖溶液，直到RQ大于1的時(shí)候，停止流加，如此反復(fù)進(jìn)行，直到發(fā)酵結(jié)束。

采用RQ?Stat的補(bǔ)料工藝，在10 L發(fā)酵罐上進(jìn)行了裂殖壺菌的分批補(bǔ)料發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果以及發(fā)酵過程的RQ變化情況如圖5和圖6所示。

圖5 裂殖壺菌RQ?Stat補(bǔ)料工藝的分批發(fā)酵過程曲線Fig.5 Time courses of DHA production in RQ?Stat fed?batch fermentation process by Schizochytrium sp.

從圖5和圖6可以看出，通過基于發(fā)酵過程的呼吸商控制的補(bǔ)料方式，使得發(fā)酵過程中的葡萄糖濃度維持在了一個(gè)較低的水平。RQ?Stat的補(bǔ)料工藝的發(fā)酵結(jié)果與間歇式的補(bǔ)料工藝的發(fā)酵結(jié)果的比較，結(jié)果如表1所示。

圖6 裂殖壺菌RQ?Stat補(bǔ)料工藝的分批發(fā)酵過程RQ的變化Fig.6 Changes of RQ in RQ?Stat fed?batch fermentation process by Schizochytrium sp.

表1 裂殖壺菌產(chǎn)DHA的不同補(bǔ)料工藝的發(fā)酵結(jié)果Table 1 Fermentation results of different feeding processes for DHA production by Schizochytrium sp.

由表1中可知：采用RQ?Stat的補(bǔ)料工藝，由于發(fā)酵過程中的葡萄糖濃度維持在較低水平，最終得到的生物量較低，但是由于其他代謝產(chǎn)物的減少，以及發(fā)酵過程中O2供應(yīng)維持在較低水平，使得最終獲得的油脂含量、DHA產(chǎn)量和產(chǎn)率比間歇式補(bǔ)料工藝分別提高了11.58%、12.19%和11.40%。此外，由于該工藝是基于RQ在線檢測(cè)控制的補(bǔ)料工藝，可以實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程補(bǔ)料的自動(dòng)化控制。

3 結(jié) 論

通過對(duì)裂殖壺菌產(chǎn)DHA的發(fā)酵過程尾氣中的O2和CO2含量進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，對(duì)裂殖壺菌發(fā)酵產(chǎn)DHA過程的呼吸參數(shù)在線檢測(cè)分析方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)補(bǔ)料分批發(fā)酵過程及雙階段補(bǔ)料分批發(fā)酵過程的各個(gè)時(shí)期的呼吸參數(shù)的在線檢測(cè)分析，從而獲得了裂殖壺菌補(bǔ)料分批發(fā)酵過程的相關(guān)基質(zhì)代謝情況及氧消耗情況的信息。此外，在對(duì)補(bǔ)料分批發(fā)酵過程的RQ變化情況的在線檢測(cè)分析基礎(chǔ)上，開發(fā)出一種基于RQ在線檢測(cè)的RQ?Stat補(bǔ)料工藝，最終獲得的油脂含量、DHA產(chǎn)量和產(chǎn)率比間歇式補(bǔ)料工藝分別提高了11.58%、12.19%和11.40%，并且該補(bǔ)料工藝可以實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程補(bǔ)料的自動(dòng)化控制。

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Online analysis of respiratory parameters in fed?batch fermentation process for DHA production by Schizochytrium sp.

QU Liang，REN Lujing，HUANG He

（College of Life Science and Pharmaceutical Engineering，State Key Laboratory of Materials?Oriented Chemical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China）

A method for online analysis of respiratory parameters in fermentation process for DHA production by Schizochytrium sp.was developed by detecting the concentration of oxygen and carbon dioxide in the exhaust gas online using exhaust gas analyzer.Online analysis of the respiratory parameters in fed?batch fermentation process and two?stage oxygen supply fed?batch process was accomplished.The theoretical explanation for the improvement of biomass，lipids and DHA content was made by using respiratory parameter online analysis，providing theoretical guidance for the two?stage oxygen supply process.In addition，according to the change of respiratory parameters in different growth periods of fermentation process，the online automatic feeding controlmethod based on changes in respiratory quotient was built and a RQ?Stat feeding processwas designed.The fermentation results of lipids and DHA content and DHA productivity were increased by 11.58%，12.19%，and 11.40%，higher than that of the pulse feeding process.

DHA；Schizochytrium；feeding strategy；respiratory parameter

R282.71

A

1672-3678（2013）06-0058-05

10.3969／j.issn.1672-3678.2013.06.012

2012-12-31

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2012AA021704）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAD23B03）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK2012424）；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃（CXLX11＿0366）

瞿 亮（1986—），男，江蘇鎮(zhèn)江人，博士研究生，研究方向：生物化工；任路靜（聯(lián)系人）：講師，E?mail：renlujing＠njut.edu.cn