于相麗，李勇慧，秦 磊

(洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)系，河南洛陽471022)

0 引言

茜草(Rubia Cordifolia L.)為茜草科茜草屬植物，別名活血草、鋸子草、拉拉草、血見愁等。分布于歐洲、亞洲、美洲和南部非洲［1］。中國有12 種［2］，主產(chǎn)于陜西省、江蘇省、安徽省、河南省、山東省。茜草為中國傳統(tǒng)常用中藥之一，藥用其干燥根及根莖，有涼血、止血、祛瘀、通經(jīng)等功效［3］。

目前，國內(nèi)對茜草的化學(xué)成分和藥理作用有廣泛的研究，茜草中主要含有水溶性的環(huán)已肽類系列物質(zhì)，脂溶性成分蒽醌及其糖苷、萘醌及其糖苷，此外還含有萜類、β 谷甾醇、脂肪酸化合物和微量元素［4－5］?，F(xiàn)代藥理研究證明:茜草根水提液在體外對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、流感桿菌和部分皮膚真菌等均有一定的抑制作用［6］，但是對茜草有機(jī)溶劑的提取及根不同部位的抑菌效果沒有系統(tǒng)的試驗研究。本文采用不同濃度的乙醇作溶劑，研究茜草根不同部位提取液對常見的3 種細(xì)菌的抑菌效果，以期為茜草的質(zhì)量控制和臨床使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用茜草于2010 年9 月份采挖于洛陽市孟津縣，陰干后將其根分為3 類，即塊狀的基部根、直徑＞8 mm 的粗根以及直徑＜8 mm 的細(xì)根，分別粉碎并密封保存。

1.2 菌種

供試菌種為大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，由洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)系微生物實驗室提供。

1.3 主要儀器設(shè)備

QYC-2102 大容量雙層全溫?fù)u床(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);SW-CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);101-1AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司);LDZX-40KB 不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);RE-201C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.4 培養(yǎng)基與試劑

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基［7］:牛肉膏，蛋白胨，瓊脂，NaCl(HCl 或NaOH 調(diào)pH 值7.2 ～7.4)。

試劑為無水乙醇，無菌生理鹽水等。

1.5 方法

1.5.1 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取物的制備［8］

取干燥粉碎后的茜草根樣品10 g 置于錐形瓶中，加蒸餾水100 mL，55 ℃水浴1 h 后，過濾，殘渣加蒸餾水100 mL 于55 ℃水浴1 h，再重復(fù)1 次，最后將3 次濾液合并，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮至黏著狀，用水溶解并定容10 mL，制成1 g/mL 的水懸濁液。以上述方法分別獲得體積分?jǐn)?shù)分別為0%、50%、60%、70%、80%的茜草根提取液，依次標(biāo)記為0%、50%、60%、70%、80%，備用。

1.5.2 菌懸液的制備

將供試菌種置于滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、120 r/min 的搖床上培養(yǎng)24 h，經(jīng)涂片鏡檢確定為單一菌種后，用無菌生理鹽水將菌液稀釋成0.5 ×109個/mL 左右。將該菌液置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 藥敏紙片法測定抑菌圈［9］

用打孔器將濾紙打成孔徑為5 mm 的圓紙片，高壓蒸汽滅菌。分別取3 mL 的0%提取液的基部根、粗根、細(xì)根原液于滅菌平皿中，加入等體積的蒸餾水，將滅菌濾紙浸泡30 min 后，置于55 ℃的干燥箱中烘干制成藥敏紙片。在超凈工作臺上將滅菌后的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌平皿中，每皿約20 mL，取3種供試菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)0.1 mL 均勻涂布到直徑為100 mm 的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，用無菌鑷子夾取烘干的濾紙片貼在含菌培養(yǎng)基表面，并輕輕按壓使充分接觸，每皿等距離放4 片，并再放入一個浸生理鹽水的紙片作為空白對照，每個試驗平行5 次，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 ～24 h 后培養(yǎng)觀察并測定抑菌圈直徑大小，取平均值。結(jié)果為5 次平行試驗的平均值，取兩位有效數(shù)字。同樣方法分別進(jìn)行50%、60%、70%、80%提取液的藥敏紙片法測抑菌圈試驗操作，計算出抑菌圈的直徑并取平均值。將所得的試驗結(jié)果進(jìn)行分析比較，從而得出最佳抑菌效果的茜草提取液以進(jìn)行下面的試驗操作。

1.5.4 最小抑菌濃度(MIC)的測定［9］

在特殊條件下培養(yǎng)24 h，可抑制某種微生物出現(xiàn)明顯增長的最低藥物濃度即最小抑菌濃度。將具有最佳抑菌效果的提取原液(1 g/mL)用無菌水按照1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64 的體積比進(jìn)行倍半稀釋，得到6 個濃度的稀釋提取液，加之原液一共有7 個濃度梯度的提取液，并且分為基部根、粗根、細(xì)根3 種。在無菌培養(yǎng)皿中分別加入1.5 mL 不同濃度和不同種類的茜草提取液，然后倒入20 mL 的55 ℃左右滅菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混勻，冷卻凝固。分別取0.1 mL 的供試菌懸液，并分別加入到70 mL的無菌生理鹽水中混勻，制成濃度106個/mL 左右的菌懸液。取0.1 mL 的稀釋菌懸液于平板上涂布均勻，每一系列培養(yǎng)基接種一種菌，每個濃度做3 個重復(fù)，以未添加提取液的系列培養(yǎng)基作為空白對照，然后置于37 ℃下培養(yǎng)24 h 后觀察。無菌生長的最低濃度即為提取物的MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 茜草根不同提取物的抑菌效果比較

表1 為茜草根不同部位的提取液對3 種菌的抑菌圈直徑，由表1 可知:水的提取液對3 種供試菌的抑菌效果不明顯，而用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇提取的茜草液(濃度為0.5 g/mL)抑菌效果較好。由表1 還可以看出:60%乙醇提取液對3 種菌均有相對較好的抑菌效果;從60%乙醇提取液的抑菌活性向兩側(cè)整體呈減小趨勢。為了驗證這一結(jié)論，又多次重復(fù)50%和70%乙醇提取液的抑菌實驗，結(jié)果沒有顯著差異。60%乙醇茜草基部根提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為7.80 mm、8.78 mm、7.88 mm。60%乙醇茜草粗根提取液對3 種菌的抑菌圈直徑分別為7.65 mm、8.63 mm、7.58mm。60%乙醇茜草細(xì)根提取液對3 種菌的抑菌圈直徑分別為7. 08 mm、7. 80 mm、8.58mm。由50%、70%、80%乙醇提取液抑菌效果及上述結(jié)果表明:茜草根不同部位提取液總體上對金黃色葡萄球和枯草芽孢桿菌的抑菌效果要比大腸桿菌的效果好，特別是60%細(xì)根提取液對枯草芽孢桿菌抑菌效果要比基部根和粗根明顯。

表1 茜草根不同部位的提取液對3 種菌的抑菌圈直徑

表2 為不同提取液抑菌效果差異顯著性分析。由表2 可知:60%提取液與50%、70%、80%及水提取液均有極顯著差異，60%乙醇提取液抑菌效果最好，所以在MIC 的確定中，使用60%乙醇提取液。

表2 不同提取液抑菌效果差異顯著性分析

對于不同菌種的抑菌活性差異見表3。由表3 看出:茜草根提取液對大腸桿菌抑菌效果較差，而對于枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌來說，其效果有顯著差異。

表3 不同菌種抑菌活性的差異顯著性

2.2 茜草根不同提取物對3 種供試菌的MIC 的測定和比較

表4 為不同茜草根60%乙醇提取液MIC。由表4 可知:對照組有大量的菌生長，說明待測物的抗菌活性來自于其本身。茜草基部根提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度分別為0.250 g/mL、0.125 g/mL、0.125 g/mL;茜草粗根提取液對3 種供試菌的最低抑菌濃度分別為0.250 g/mL、0.125 g/mL、0.125 g/mL;茜草細(xì)根提取液對3 種菌的最低抑菌濃度分別為0.500 g/mL、0.250 g/mL、0.125 g/mL。說明茜草的基部根、粗根、細(xì)根提取液對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌效果優(yōu)于大腸桿菌。

表4 不同茜草根60%乙醇提取液MIC g/mL

3 討論

茜草根不同部位的抑菌活性有顯著差異，以基部根效果最好，說明其藥效也是最好的，基部根正處于根和莖連接處，抑菌物質(zhì)合成與運輸都要通過此處，故其有效成分含量較高，抑菌效果最好。而細(xì)根由于處于快速生長期，其抑菌物質(zhì)的積累較少，故抑菌效果較差。

茜草抑菌物質(zhì)的提取時間和提取溫度也會影響試驗結(jié)果，在提取過程中抑菌物質(zhì)會有一定的損失，在一定程度上也會影響試驗結(jié)果。不同地域的茜草根含有的抑菌物質(zhì)的含量也不盡相同，需要進(jìn)一步地對本地產(chǎn)茜草的抑菌物質(zhì)進(jìn)行分析，以得出抑菌物質(zhì)的成分，將有利于人們利用茜草，發(fā)揮其作用。

［1］ 侯寬昭.中國種子植物科屬詞典［M］.北京:科學(xué)出版社，1982:422.

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［3］ 藥典編委會.中華人民共和國藥典:第一部［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005.

［4］ 方曉艷，孫艷紅，楊林莎.茜草的研究進(jìn)展［J］.河南中醫(yī)藥學(xué)刊，2002，17(5):78－80.

［5］ 張振英，黃顯峰.茜草的藥理作用研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，17(5):58－60.

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［8］ 譚朝陽，尤昭玲.茜草提取工藝的研究［J］.中草藥，2004，35(4):399－401.

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