四倍體刺槐枝條韌皮部總蛋白質(zhì)雙向電泳體系建立及應(yīng)用

張勝 趙忠，2 劉昭軍 張博勇，2 宗建偉 張玲玲

（1.西北農(nóng)林科技大學林學院，楊陵 712100；2.西北農(nóng)林科技大學 西部環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，楊凌 712100）

雙向電泳技術(shù)由O’Farrell［1]于1975年首次建立，并成功分離約1 000個E. coli蛋白質(zhì)。雙向電泳是通過兩個方向相互垂直的電泳，將樣品中的蛋白質(zhì)按照等電點和分子質(zhì)量的不同而呈點狀分離［2]。雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學研究的核心技術(shù)之一［3]，對雙向電泳技術(shù)的研究與探索是后續(xù)蛋白質(zhì)組學研究的基礎(chǔ)。雙向電泳技術(shù)流程包括組織蛋白質(zhì)的提取、第一向等電聚焦（IEF）、第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離、凝膠染色、凝膠圖像掃描及分析等基本步驟。對于雙向凝膠電泳分析來說樣品的制備，膠條、分離膠濃度選擇，上樣量控制，等電聚焦條件設(shè)置等都影響試驗結(jié)果。因此，為了獲得最佳的電泳分離效果需要建立一套穩(wěn)定、高效的電泳條件組合。

組織蛋白質(zhì)的提取是雙向電泳技術(shù)研究的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)提取的好壞將直接影響2-D凝膠圖譜質(zhì)量。通常影響雙向電泳結(jié)果的最主要的原因是樣品的制備［4]。植物組織中含較多的非蛋白成分，如多糖、酚類、色素、脂類、單寧及其它次級代謝物，這些物質(zhì)會對雙向電泳圖譜中蛋白質(zhì)的分離產(chǎn)生一定的影響［5]。選擇合適的蛋白質(zhì)提取方式能夠有效的去除雜質(zhì)、純化蛋白。TCA/丙酮法是一種提取植物總蛋白質(zhì)的有效方法［6]，該方法已在小麥花藥、葉片和籽粒［7，8]，番茄葉片［9，10]，大豆葉片［11]、種子［12]，甘藍型油菜［13]等眾多植物中取得了良好的效果。

由于四倍體刺槐的優(yōu)良性狀［14]，近年來對它的研究也陸續(xù)展開。四倍體刺槐從蛋白組學方面的研究雖然有過報道但從2D圖譜上看蛋白質(zhì)分離效果并不理想，圖譜中有明顯的橫縱條紋，且背景不清楚、聚焦不完全。本研究從分離膠濃度、IPG膠條選擇到上樣量、等電聚焦參數(shù)等條件進行優(yōu)化，旨在得到更為理想的、更便于分析的凝膠圖譜。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品 供試材料為3年生四倍體刺槐根繁苗萌條，采自西北農(nóng)林科技大學林學院苗圃。剪取四倍體刺槐生長健壯的枝段，用蒸餾水清洗后，刮取韌皮部并用錫箔紙包好放液氮內(nèi)速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 儀器和試劑 17 cm IPG干膠條（pH3-10、pH4-7、 pH5-8）（Bio-Rad），PROTEAN IEF Cell（Bio-Rad），PROTAIN IEF Cell型電泳系統(tǒng)（Bio-Rad），PowerLook2100XL掃描儀，PDQuest 2DE7.4分析軟件（Bio-Rad）。藥品均為分析純，藥品溶液均使用超純水配置。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)的提取與定量

1.2.1.1 蛋白質(zhì)的提取 四倍體刺槐全蛋白質(zhì)的提取方法為三氯乙酸/丙酮沉淀法［15]，并加以改進：液氮預(yù)冷研缽，取2 g四倍體刺槐韌皮部樣品，加入10% PVPP（聚乙烯吡咯烷酮）和少量石英砂，充分研磨。加入5倍體積-20℃預(yù)冷的10%三氯乙酸/丙酮溶液（含有0.07 %的β-巰基乙醇），渦旋震蕩后-20℃靜置2 h以上。4℃，1 100 r/min離心30 min，棄上清，沉淀復(fù)溶于冷丙酮（含0.07%的β-巰基乙醇），-20℃放置1 h。4℃，11 000 r/min離心30 min，棄上清，冷丙酮沖洗沉淀，重復(fù)2-3次；棄上清后放入通風廚自然揮發(fā)丙酮。將制成的干粉每克加入2 mL裂解液［7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% 3-（3-膽胺丙基）] 渦旋混勻，置于30℃水浴1 h，不時震蕩，充分溶解蛋白。常溫11 000 r/min離心30 min，取上清液，定量，-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 蛋白質(zhì)的定量 蛋白質(zhì)定量使用天艮Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒，得到標準曲線，利用標準曲線算出蛋白質(zhì)大致濃度。

1.2.2 雙向電泳分析（2-DE）

1.2.2.1 第一向固相pH梯度等電聚焦（IEF）將蛋白質(zhì)樣品與水化上樣緩沖液（含8 mol/L尿素，2%CHAPS，0.001%溴酚藍，45 mmol/L DTT，0.2% Biolyte pH3-10）充分混勻。取混合溶液350 μL，加入聚焦槽。將IPG膠條室溫下放置10 min，膠面朝下，按正負極放入聚焦槽內(nèi)，確保無氣泡。在膠條上覆蓋一層礦物油（2-3 mL）蓋上聚焦槽蓋，將聚焦槽放入Bio-Rad等電聚焦儀（PROTEAN IEF Cell，Bio-Rad Hercules，CA，USA）上。操作方法按照Bio-Rad聚焦程序操作手冊《2-D Electrophoresis principle and methods》設(shè)定，在第一向程序設(shè)定上略作修改（表1）。在20℃條件下主動水化14 h，使膠條充分吸收蛋白質(zhì)樣品后按程序進行第一向等電聚焦電泳。

1.2.2.2 第二向垂直板電泳（SDS-PAGE） 第一向等電聚焦結(jié)束后，取出含蛋白樣品的IPG膠條，放于水化盤中平衡，依次加入5 mL/gel平衡液A［平衡緩沖母液（6.0 mol/L尿素，2% SDS，0.375 mol/L Tris-HCl（pH8.8），20%甘油）+ 2% DTT（現(xiàn)加）] 和5 mL/gel平衡液B［平衡緩沖母液+2.5%碘乙酰胺（現(xiàn)加）] ，各平衡15 min。用1×電泳緩沖液稍沖洗IPG膠條后迅速轉(zhuǎn)移至分離膠上端，擠壓上端膠條，排凈氣泡，使IPG膠條與分離膠緊密接觸。用1%低熔點瓊脂糖凝膠封膠。將SDS-PAGE膠架放入PROTAIN IEF Cell 型電泳系統(tǒng)（Bio-Rad）中。加入電泳緩沖液，接通電源，起始時用低電流（5 ma/gel/17 cm），待樣品完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，加大電流（20-30 ma/gel/17 cm），待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時停止電泳。卸下玻璃板，取出凝膠，超純水沖洗2-3次后開始凝膠染色。

表1 等電聚焦程序設(shè)定

1.2.2.3 凝膠染色 本研究采用了兩種染色方法對四倍體刺槐枝段韌皮部全蛋白進行染色。分別用與質(zhì)譜兼容的考馬斯亮藍染色和靈敏度高的硝酸銀染色。

硝酸銀染色［16]第一步超純水沖洗凝膠3次，固定1 h，固定液（40%無水乙醇+10%冰乙酸+50%超純水）。第二步敏化30 min，敏化液（17 g乙酸鈉+0.5 g硫代硫酸鈉+75 mL無水乙醇+超純水至250 mL）。第三步水洗3次×10 min。第四步染色，染色液［0.625 g碳酸鈉+超純水至250 mL（用時現(xiàn)加100 μL甲醛）] 。第五步水洗2次×1 min。第六步顯色（視凝膠顯現(xiàn)效果定）顯色液［6.25 g碳酸鈉+超純水至250 mL（臨用前加入50 μL甲醛）] 。第七步終止10 min，終止液（3.65 g Na2EDTA+超純水至250 mL）。第八步水洗3次，每次5 min。

考馬斯亮藍染色參照參考文獻［17] 稍作改動。其基本過程為：固定（40%乙醇+10%冰乙酸+50%純水）30 min，洗滌3次，每次置于搖床上輕搖10 min，染色盤中加入考馬斯亮藍G-250染色液（1.2 g/L考馬斯亮藍G-250、100 g/L硫酸銨、100 g/L磷酸、20%乙醇）搖床搖動過夜。純水重復(fù)脫色直至背景清楚。

1.2.2.4 凝膠圖像分析 用PowerLook2100XL掃描儀掃描凝膠圖像，掃描結(jié)果直接導(dǎo)入計算機（32位，400 dpi分辨率，全彩）。并用PDQuest 2DE7.4分析軟件（美國Bio-Rad公司）分析（圖像剪切、斑點檢測等）。

2 結(jié)果

2.1 不同分離膠濃度的選擇

采用10%、12%和15%的分離膠探討了對四倍體刺槐韌皮部蛋白質(zhì)的分離效果的影響。結(jié)果（圖1）表明，分子量20 kD以下的蛋白質(zhì)在10%的分離膠中（圖1-A）未能得到分離，雖然分離度較大但條帶不夠清晰，av蛋白質(zhì)沒能完全的展現(xiàn)在凝膠上。蛋白點在12%的分離膠中（圖1-B）能充分分開，且條帶清晰蛋白質(zhì)分布較均勻。用15%的分離膠（圖1-C）可以看出蛋白質(zhì)在整個凝膠板上是分布不均勻的；由于膠濃度太大，大分子蛋白質(zhì)大量重疊，條帶不夠清晰。由以上結(jié)果可知，四倍體刺槐蛋白質(zhì)的分離膠相對適宜濃度為12%，在后續(xù)試驗中采用12%的分離膠。

2.2 不同IPG膠條pH梯度的選擇

采用pH3-10、pH4-7、pH5-8的IPG膠條對四倍體刺槐枝段韌皮部全蛋白進行雙向電泳，根據(jù)凝膠蛋白質(zhì)點的分布結(jié)果選擇最適合的pH梯度。為了盡可能多的，全面的顯現(xiàn)四倍體刺槐枝段韌皮部蛋白質(zhì)，在IPG膠條選擇試驗中采用靈敏度高的硝酸銀染色法染色，上樣量180 μg。通過pH3-10膠條（圖2-A）發(fā)現(xiàn)，四倍體刺槐韌皮部蛋白質(zhì)點主要分布在偏酸性和中性的區(qū)域，堿性區(qū)域蛋白質(zhì)點相對較少。采取窄pH范圍（pH4-7和pH5-8）的IPG膠條（圖2-B和圖2-C）進行雙向電泳試驗，兩種膠條都能得到較好的凝膠圖譜，且相比pH5-8的IPG膠條，使用pH4-7的IPG膠條能得到更多的蛋白質(zhì)點，且蛋白點在凝膠圖譜中分布均勻，斑點檢測結(jié)果見表2。

表2 兩種pH梯度下的蛋白質(zhì)點數(shù)對比

2.3 考馬斯亮藍染色上樣量的優(yōu)化

圖3中A-D四塊膠分別表示上樣量為400、450、550和650 μg 經(jīng)考馬斯亮藍G-250染色后的2-DE圖譜。四塊凝膠中A、B的背景較C、D更清晰，且橫縱條紋相對較少，但是A、B兩塊凝膠上樣量少，蛋白質(zhì)點數(shù)也較C、D凝膠少，丟失許多低豐度蛋白質(zhì)。D凝膠，上樣量較大，高峰度的蛋白質(zhì)點將其周邊蛋白質(zhì)點覆蓋，影響圖像效果，C凝膠較D凝膠分辨率高且蛋白點更圓，見圖3-CⅠ和圖3-DⅢ區(qū)、3-CⅡ和圖3-DⅣ區(qū)放大圖。C凝膠雖然背景沒有A、B清晰但蛋白質(zhì)點數(shù)最多，而且蛋白質(zhì)點形狀更圓。4種不同上樣量蛋白質(zhì)點檢測結(jié)果如表3所示?？梢姡捎每捡R斯亮藍染色時550 μg的上樣量對于四倍體刺槐韌皮部總蛋白2-DE分析是最佳的。

表 3 考馬斯亮藍染色不同上樣量蛋白質(zhì)點數(shù)對比

2.4 第一向等電聚焦時間的優(yōu)化

等電點聚焦是影響雙向電泳凝膠圖像好壞的重要因素。聚焦時間同膠條pH梯度、長度、蛋白質(zhì)上樣量的大小有關(guān)。若聚焦不充分，會在凝膠圖上呈現(xiàn)蛋白質(zhì)點的橫向條紋、蛋白質(zhì)點不夠圓等問題，最終影響分析結(jié)果。但聚焦時間過長也并不能改變分辨效果。Bio-Rad實驗操作手冊中將17 cm IPG膠條的總聚焦功率設(shè)為60 000 Vh，但60 000 Vh的總聚焦功率并不能將四倍體刺槐韌皮部蛋白充分聚焦，蛋白質(zhì)凝膠圖上橫條紋較多（圖4-A），且當上樣量較大時不能充分聚焦的現(xiàn)象尤為明顯。實際操作中將總聚焦功率設(shè)為80 000 Vh（表1），加大功率后凝膠圖上基本消除了橫條紋，且蛋白質(zhì)點形狀比較圓，如圖4-B所示。

2.5 四倍體刺槐扦插愈傷組織階段蛋白質(zhì)組份分析

采用優(yōu)化的體系分析四倍體刺槐扦插愈傷組織形成階段蛋白質(zhì)變化情況，經(jīng)PowerLook2100XL掃描儀掃描凝膠圖像，PDQuest7.4軟件進行自動匹配結(jié)合肉眼觀察及人工匹配，保留對照（0 d）370個，愈傷組織形成期（10 d）368個肉眼可見且點形較圓的斑點作為最后分析。結(jié)果（圖5）顯示，與對照（圖5-A）相比在扦插10 d愈傷組織形成期（圖5-B）共有83個差異蛋白質(zhì)，其中上調(diào)蛋白質(zhì)15個，新產(chǎn)生蛋白質(zhì)22個，下調(diào)蛋白質(zhì)22個，缺失表達24個。圖6為個別差異蛋白質(zhì)點的放大圖，其中圖6-A表示對照（0 d），圖6-B為愈傷組織形成期。

3 討論

對于蛋白質(zhì)組學研究來說，高質(zhì)量的雙向電泳圖譜是后續(xù)分析的基礎(chǔ)，對研究材料進行雙向電泳條件的優(yōu)化是非常重要和必要的。合適的蛋白質(zhì)提取方法能消除植物次生代謝物質(zhì)的干擾，改善圖譜質(zhì)量。本研究以TCA/丙酮法提取全蛋白質(zhì)，經(jīng)雙向電泳，得到的2-DE凝膠圖譜背景清晰，蛋白質(zhì)點較多。表明TCA/丙酮法適合四倍體刺槐枝段韌皮部全蛋白質(zhì)的提取。不同的分離膠濃度會影響蛋白質(zhì)分離的效果，丁承強等［18]在研究水稻根段組織雙向電泳圖譜中指出與12%的分離膠相比10%的分離膠使水稻根段組織蛋白質(zhì)點分布更加均勻，在調(diào)整好上樣量后能夠分離到更多的蛋白質(zhì)點。對于不同的植物需要選擇合適濃度的分離膠來分離蛋白質(zhì)，莊維兵等［19]發(fā)現(xiàn)10%的分離膠比較適合梅花芽蛋白質(zhì)雙向電泳，任麗萍等［20]用15%分離膠分離黃瓜葉片蛋白質(zhì)效果較好。另外，合適的分離膠濃度有利于蛋白質(zhì)分離，并且能在凝膠圖譜上顯現(xiàn)更多的蛋白質(zhì)點，對于多數(shù)植物組織來說12%的分離膠濃度較適合蛋白質(zhì)的分離［10，21-24]。對于四倍體刺槐韌皮部全蛋白質(zhì)來說其蛋白質(zhì)的分子量主要集中在20-120 kD的范圍內(nèi)，所以采用12%的分離膠是合適的。

適合的pH梯度能顯著提高凝膠蛋白質(zhì)點的分辨率。對于四倍體刺槐韌皮部全蛋白使用pH3-10膠條分離效果不好，從蛋白質(zhì)圖譜上分析得出大部分蛋白質(zhì)大致集中在pH為4-8的范圍內(nèi)。采用窄pH梯度膠條后（pH4-7、pH5-8），凝膠背景、分離效果、分辨率都得到顯著的提高。但是目前沒有pH4-8的17 cm IPG膠條，所以選擇蛋白質(zhì)點數(shù)相對較多的pH范圍膠條為分析所用。對于全面分析蛋白質(zhì)來說可以對不同的pH范圍跑出的凝膠圖譜進行分別分析。

不同的染色方法所要求的上樣量是不同的，17 cm的IPG膠條銀染上樣量在100-300 μg，考馬斯亮藍染色上用量1-3 mg。但是也因不同的樣品而有所不同。上樣量的大小直接影響雙向電泳的分辨率［25]。雙向電泳圖譜的效果直接受蛋白質(zhì)上樣量的影響，上樣量關(guān)系到試驗結(jié)果的可靠性。提高上樣量，有利于檢測低豐度蛋白，但上樣量過高時，會產(chǎn)生橫縱條紋，高豐度蛋白質(zhì)的斑點會影響其他蛋白質(zhì)點的分離和分析［26]。上樣量太小，低豐度蛋白無法顯示在凝膠上；上樣量過大凝膠背景不清，凝膠上出現(xiàn)大量的橫條紋，高豐度蛋白形成遮蓋效應(yīng)使蛋白點分離度降低。所以探索最佳的上樣量對于凝膠蛋白點分析很有意義，對于四倍體刺槐枝段韌皮部蛋白質(zhì)雙向電泳考馬斯亮藍染色上樣量從400 μg增加到550 μg時蛋白點數(shù)也是呈上升趨勢，但再增加100 μg時蛋白點數(shù)反而下降了，而且分辨率明顯下降，原因是上樣量較大，形成較多的橫線和拖尾，影響蛋白點分析。

聚焦時間同膠條的長度、pH梯度、載體兩性電解質(zhì)以及蛋白質(zhì)上樣量有關(guān)［26]。Bio-Rad試驗操作手冊對等電聚焦做了參考的程序設(shè)置，但是在實際試驗操作中需要根據(jù)自己實際的樣品做調(diào)整，既要防止聚焦時間不夠所造成圖譜上大量橫條紋、聚焦不完全和蛋白質(zhì)點不圓，又要防止過聚焦所造成的橫條紋和蛋白質(zhì)因長時間聚焦所造成的損失。

采用優(yōu)化的體系對四倍體刺槐扦插枝段韌皮部進行雙向電泳，分析差異表達蛋白質(zhì)，希望從蛋白質(zhì)組學角度解釋四倍體刺槐扦插生根機理。對于這些差異表達的蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定、數(shù)據(jù)庫檢索及蛋白質(zhì)功能分析作者實驗室正在進行中。

4 結(jié)論

本研究以TCA/丙酮法為蛋白質(zhì)提取方法，采用pH4-7的17 cm IPG膠條，12%的分離膠濃度，考馬斯亮藍染色上樣量550 μg，等電聚焦在60 000 Vh的基礎(chǔ)上提高20 000 Vh能得到背景清晰、蛋白質(zhì)點數(shù)多、分離度高且重復(fù)性好的電泳凝膠圖譜，經(jīng)過優(yōu)化建立起了適合于四倍體刺槐枝段韌皮部雙向電泳體系。用優(yōu)化的體系對四倍體刺槐扦插當天（0 d）和愈傷組織形成階段（10 d）采集的樣品進行蛋白質(zhì)雙向電泳分離，將得到凝膠圖譜經(jīng)軟件檢測分析得到83個差異蛋白質(zhì)點，其中上調(diào)蛋白15個，新產(chǎn)生蛋白22個，下調(diào)蛋白22個，缺失表達24個。

［1] O’Farrell PH. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins［J] . The Journal of Biological Chemistry, 1975, 250（10）：4007-4021.

［2] G?rg A, Weiss W, et al. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics［J] . Proteomics, 2004, 4（1）：3665-3685.

［3] 馬洪雨, 王占奎, 俞闐, 等.適用于黃麻根部蛋白質(zhì)組學分析的雙向電泳技術(shù)［J] .西北植物報, 2010, 30（1）：195-202.

［4] Wilkins MR, Appel RD, Williams KL, Hochstrasser DF. Proteome research：Concepts, technology and application［M] . Berlin Heidelberg：Springer-Verlag, 2007.

［5] Shaw MM, Riederer BM. Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis［J] . Proteomics, 2003, 3：1408-1417.

［6] Jacobs DI, van Rijssen MS, van der Heijden R, Verpoorte R. Sequential solubilization of proteins precipitated with trichloroacetic acid in acetone from culturedCatharanthus roseuscells yields 52% more spots after two-dimensional electrophoresis［J] . Proteomics, 2001, 1（11）：1345-1350.

［7] 葉景秀, 陳蕊紅, 張改生, 等.殺雄劑SQ-1誘導(dǎo)小麥雄性不育花藥蛋白質(zhì)組分分析［J] .農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學, 2009, 17（5）：858-864.

［8] 寧書菊, 趙敏, 向小亮, 等.不同氮素水平下水稻生育后期葉片和籽粒的蛋白質(zhì)組學［J] .應(yīng)用生態(tài)學報, 2010, 21（10）：2573-2579.

［9] Saravanan RS, Rose JKC. A critical evaluation of sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues［J] . Proteomics, 2004, 4（9）：2522-2532.

［10] 黎飛, 徐秋芳, 臧憲朋, 等.番茄子葉總蛋白雙向電泳體系的建立［J] .園藝學報, 2010, 37（4）：661-668.

［11] 顧憲鵬, 羅秋蘭, 高繼國, 等.大豆葉片蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)的改良［J] .大豆科學, 2011, 30（4）：663-667.

［12] De La Fuente M, Borrajo A, Bermudez J, et al. 2-DE-based proteomic analysis of common bean seeds［J] . Journal of proteomics, 2011, 74（2）：262-267.

［13] 甘露, 李殿榮, 臧新, 等.甘藍型油菜蛋白質(zhì)雙向電泳體系的建立［J] .作物學報, 2010, 36（4）：612-619.

［14] 李云, 姜金仲.我國飼料型四倍體刺槐研究進展［J] .草業(yè)科學, 2006, 23（1）：41-46.

［15] Imin N, Kerim T, Weinman JJ, et al. Characterization of rice anther proteins expressed at the young microspore［J] . Proteomics,2001, 1（9）：1149-1161.

［16] Westermeier R, Naven T. Proteomics in practice：A laboratory manual of proteome analysis［M] . Weinheim：WILEYVCH Verlag GmbH, 2002.

［17] Candiano G, Bruschi M, Musante L, et al. Blue silver：A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis［J] . Electrophoresis, 2004, 25（9）：1327-1333.

［18] 丁承強, 馬丹, 王紹華, 等.水稻蛋白質(zhì)組雙向電泳優(yōu)化流程及方法［J] .植物學報, 2011, 46（1）：67-73.

［19] 莊維兵, 高志紅, 章鎮(zhèn), 等.果梅花芽蛋白質(zhì)雙向電泳優(yōu)化體系的建立［J] .南京農(nóng)業(yè)大學學報, 2011, 34（6）：47-52.

［20] 任麗萍, 范海延, 王珊珊, 等.黃瓜葉片蛋白質(zhì)雙向電泳樣品分級優(yōu)化［J] .西北植物學報, 2011, 31（8）：1706-1710.

［21] 付忠軍, 丁冬.進茜寧, 等.玉米花絲蛋白質(zhì)組雙向電泳條件的優(yōu)化［J] .植物生理學通訊, 2009, 45（12）：1215-1220.

［22] 王娟, 倪志勇, 呂萌, 等.棉花纖維伸長期與次生壁增厚期蛋白質(zhì)組比較［J] .作物學報, 2010, 36（11）：2004-2010.

［23] 顧憲鵬, 羅秋蘭, 高繼國, 等.大豆葉片蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)的改良［J] .大豆科學, 2011, 30（4）：663-667.

［24] 王娟, 倪志勇, 呂萌, 等.棉花纖維伸長期與次生壁增厚期蛋白質(zhì)組比較［J] .作物學報, 2010, 36（11）：2004-2010.

［25] 魏開華, 應(yīng)天翼, 編著.蛋白質(zhì)組學試驗技術(shù)精編［M] .北京：化學工業(yè)出版社, 2010.

［26] Pasquali C, Fialka I, Huber LA. Preparative two-dimensional gel electrophoresis of membrane proteins［J] . Electrophoresis, 1997,18（14）：2573-2581