施春霖，劉聰，肖旦望，陳社員，官春云，熊興華

(作物基因工程湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

植物油不僅是人類飲食的主要組成部分，還在工業(yè)和生物能源上有很好的應用和發(fā)展前景[1]。由于種子含油量是受多基因控制的，長期以來利用調控種子脂肪酸代謝中的關鍵酶基因來達到提高含油量的效果并不理想，但通過轉錄因子對相關代謝途徑的1 組基因進行遺傳修飾，可以更有效地達到提高含油量的目的[2]。種子的胚胎發(fā)育和脂肪酸代謝途徑涉及許多復雜的過程，這些過程都受到許多轉錄因子的調控[3–7]，這些轉錄因子相互之間存在聯(lián)系，形成1 個調控網絡，共同調控種子胚的發(fā)育和成熟以及油脂的形成[8]。Focks 等[9]采用梯度離心篩選出了1 個低含油量、種皮發(fā)皺的突變體wri1，圖位克隆發(fā)現(xiàn)，控制該性狀的基因WRI1 編碼1 個DNA 結合轉錄因子，功能缺失時致使含油量降低80%，而過表達卻使含油量提高20%左右。對WRI1 突變體進行生物化學分析顯示，突變體中幾種糖酵解酶，比如質體丙酮酸激酶、?；d體蛋白(ACP)、3–酮酯酰–ACP 合成酶、烯酯酰–ACP 還原酶等活性明顯低于野生型水平的。這些在WRI1 突變體中表達水平低的基因，多數(shù)是參與脂肪和糖酵解的基因，而且它們的積累模式與種子油的一致，這說明WRI1 很可能調控這些基因的表達。Cernac 等[6]和Masaki 等[10]的研究都證明了這一假設。Baud 等[11]的研究還發(fā)現(xiàn)了WRI1 新的靶基因，包括脂肪酸合成酶基因、硫辛酸和生物素合成途徑相關酶基因，但內質網的脂肪酸脫氫酶和延伸酶基因不受WRI1 的調控，暗示著WRI1 基因可能在控制種子發(fā)育和油脂積累過程中起著關鍵性作用。后來一系列的研究[12–16]發(fā)現(xiàn)，WRI1 基因確實在油脂的合成方面起著重要作用。To等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中存在多拷貝WRI1 基因，且部分WRI1 基因拷貝對油脂的合成調控作用不明顯。另外，由于甘藍型油菜(B. napus，2n=38,AACC)起源于白菜(B. rapa，2n=20,AA)和甘藍(B.oleracea，2n=18,CC)的天然雜交和染色體組自然加倍，因此，甘藍型油菜中可能存在不同WRI1 基因，且對含油量的影響可能不同。筆者以甘藍型油菜湘油15 號為材料，克隆甘藍型油菜的WRI1 基因，并對序列進行分析，旨在有目的地調控該轉錄因子基因，為培育高含油量的油菜品種提供便利。

1 材料與方法

1.1 供試材料

甘藍型油菜湘油15 號(Brassica napus,2n=38,AACC)，由國家油料改良中心(湖南)提供；矮腳小白菜(B. rapa，2n=20，AA)、強夏甘藍(B.oleracea，2n=18，CC)，由植物病蟲害防治湖南省重點實驗室提供；大腸桿菌DH5α 由作物基因工程湖南省重點實驗室保存。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑：EASYspin 植物RNA 快速提取試劑盒及TUREscript 1stStrand cDNA Synthsis Kit 試劑盒，購自北京艾德萊生物科技有限公司；高保真Pfu及EasyPure Quick Gel Extraction Kit 切膠回收試劑盒，購自北京全式金生物科技有限公司；連接載體pMD18–T Simple Vector 及相關限制性內切酶，購自Takara 生物技術有限公司。

主要儀器：Eppendorf Centrifuge 5804R 臺式冷凍高速離心機；MiKRO 220R 高速離心機；UV–1700 PharmaSpec 紫外分光光度計；Pharmacia MultiTemp Ⅲ恒溫水浴鍋；HIRAYAMA 全自動高溫滅菌鍋；MJ Research PTC–200 PCR 儀。

1.3 總RNA 提取和第一鏈cDNA 合成

按EASYspin植物RNA快速提取試劑盒的操作說明從供試材料單株單片新鮮葉中提取總RNA。按照TUREscript 1stStrand cDNA Synthsis Kit 的操作說明，以提取的總RNA 為模板，反轉錄合成第一鏈cDNA。

1.4 引物設計與PCR 擴增

以 GenBank WRI1 mRNA 全長編碼序列(DQ370141)為參考，利用Primer 5.0 設計引物FW：下劃線部分分別為Bam HI 位點和Sac I 位點。分別以3 種供試材料的第一鏈cDNA 為模板，進行PCR 擴增。PCR反應體系為20 μL，包括cDNA 模板2 μL，10×Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，引物各1 μL，5 U/μL 高保真Pfu 0.5 μL，ddH2O11.5 μL。PCR 擴增程序為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性40 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸100 s，30 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。反應終止后，取PCR 產物在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。用切膠回收試劑盒回收目的條帶，用于載體連接反應。

1.5 載體連接與測序

將回收產物連接至pMD18–T Simple Vector，連接體系為10 μL，包括回收產物3 μL，pMD18-T Simple Vector 1 μL，Solution I 5 μL，ddH2O 1 μL，16 ℃連接1 h。采用熱激法將連接產物轉化至大腸桿菌，篩選陽性克隆。取陽性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.6 序列分析與酶切檢測

采用DNAman 進行序列比對，分析WRI1 基因編碼序列的單核苷酸變異；采用CLUSTAL X，MEGA5.0 軟件進行聚類系譜分析；采用Primer 5.0進行酶切位點分析；采用DNAman 進行可以識別A和C 基因組來源WRI1 的特異性酶切位點分析，用所得到的該內切酶酶切檢測3種供試材料的PCR產物；采用雙酶切檢測酶切位點變異的真實存在。

2 結果與分析

2.1 WRI1 基因mRNA 全長編碼序列的克隆

3 種供試材料均擴增出大小約為1.3 kb 的PCR產物，與目的片段大小一致(圖1)。將PCR 產物連接到PMD18–TSimple Vector 載體上，轉化大腸桿菌DH5α，陽性菌落經PCR 檢測，從湘油15 號篩選出 5 個陽性克隆，分別命名為 BnWRI1–1，BnWRI1–2，BnWRI1–3，BnWRI1–4 和BnWRI1–5；矮腳小白菜與強夏甘藍各篩選出1 個陽性克隆，分別命名為BraWRI1 和BoWRI1。測序結果顯示，BnWRI1–1 和 BraWRI1 的大小為 1 248 bp，BnWRI1–2 和 BnWRI1–3 的大小為 1 254 bp，BnWRI1–4、BnWRI1–5 和BoWRI1 的大小為1 242 bp。重復測序1 次，結果一致。

圖1 白菜、甘藍、甘藍型油菜WRI1 基因編碼序列PCR 擴增結果Fig.1 PCR amplification of WRI1 cDNA from Brassica rapa,Brassica oleracea and Brassica napus

2.2 WRI1 基因cDNA 序列的比對結果

序列比對分析結果(表1)顯示，克隆所得的WRI1 基因編碼序列共發(fā)現(xiàn)41 個單核苷酸的變異。BnWRI1–4、BnWRI1–5 在826 位和870 位分別存在9 個堿基和3 個堿基的缺失，BnWRI1–1 在1 217 到1 222 位存在6 個堿基的缺失。通過對測序結果所編碼的氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)這些堿基的缺失導致BnWRI1–4、BnWRI1–5 所編碼的氨基酸序列存在4 個氨基酸的缺失，BnWRI1–1 存在2 個氨基酸的缺失。這種序列上的變化是否會造成該蛋白存在調控方面的差異，還有待進一步研究。

表1 WRI1 編碼序列單核苷酸變異位點分布Table 1 SNPs in the coding sequences of the cloned WRI1

2.3 WRI 基因cDNA 序列系譜聚類分析

系譜聚類分析結果(圖2)顯示，所克隆WRI1 基因cDNA 在進化關系上同擬南芥AtWRI1 (At3G54320)同處1 個分支，進化關系最近，且BnWRI1–1、BnWRI1–2、BnWRI1–3 與克隆自矮腳小白菜的BraWRI1 被聚為一類，BnWRI1–4、BnWRI1–5 與克隆自強夏甘藍的BoWRI1 被聚為另外一類，且白菜和甘藍均存在和擬南芥其他幾個WRI1 基因拷貝相似的基因序列。由此可見，甘藍型油菜湘油15 號中可能有分別來源于A 基因組和C 基因組的WRI1基因，并且A 基因組與C 基因組也可能存在不同WRI1 基因拷貝。

圖2 白菜、甘藍、甘藍型油菜和擬南芥AP2–Like WRI1 基因編碼序列的聚類系譜Fig.2 Cladogram of AP2–Like WRI1 coding sequences from Brassica rapa,Brassica oleracea,Brassica napus and Arabidopsis thaliana

2.4 WRI1基因cDNA特異性酶切位點分析及酶切檢測結果

序列比對和酶切位點分析結果顯示，來源于A基因組的 BraWRI1、BnWRI1–1、BnWRI1–2 和BnWRI1–3 第892 位核苷酸為鳥嘌呤(G)，而來源于C 基因組的BoWRI1、BnWRI1–4 和BnWRI1–5 第880位核苷酸為腺嘌呤(A)。該變異導致甘藍和甘藍型油菜 C 基因組 WRI1 基因編碼序列中有 Bcl I (TGATCA)識別位點，而白菜和甘藍型油菜A 基因組WRI1 編碼序列沒有BclI 識別位點(圖3)。以內切酶BclI 酶切3 種供試材料純化后的PCR 產物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，湘油15 號的WRI1 基因編碼序列 PCR 產物被切成3 個片段，強夏甘藍的WRI1 基因編碼序列PCR 產物被切成2 個片段，而矮腳小白菜的WRI1 基因編碼序列PCR 產物沒有被切開(圖4)。提取陽性克隆質粒(連接至pMD18–T Simple vector)并依照圖5 示意方法作雙酶切檢測，結果如圖 6 所示。由此證明了不同基因組AtWRI1–Like WRI1 基因突變位點的真實存在，并且可以利用核酸內切酶Bcl I 區(qū)分甘藍型油菜A 和C基因組AtWRI1–Like WRI1 基因。

圖4 甘藍型油菜、甘藍、白菜WRI1 的PCR產物Bcl I 酶切檢測結果Fig.4 Digestion of WRI1 cDNAs from Brassica napus,Brassica oleracea and Brassica rapa by Bcl I

圖5 雙酶切檢測示意圖Fig. 5 Schematic diagram of double digests

圖6 陽性克隆的雙酶切檢測結果Fig.6 Identification of WRI1 cDNAs from Brassica napus with double digests

3 結論與討論

提高油菜種子含油量是現(xiàn)今乃至將來育種工作的重要目標。通過常規(guī)育種手段選育出了許多高含油量、高品質的油菜品種[17–21]。筆者從現(xiàn)今廣泛推廣種植的甘藍型雙低油菜品種湘油15 號中克隆出的WRI1 基因編碼序列是以GenBank WRI1 全長編碼序列DQ370141 為模板設計得到的引物，經PCR 擴增。擴增產物序列與擬南芥AtWRI1 相似。序列分析發(fā)現(xiàn)，BnWRI1–1、BnWRI1–2、BnWRI1–3與矮腳小白菜WRI1 基因編碼序列BraWRI1 來源相同。另外，BnWRI1–4、BnWRI1–5 與強夏甘藍WRI1基因編碼序列BoWRI1 來源相同。不同來源的WRI1序列上存在差異。聚類分析結果顯示，分屬A 基因組和C 基因組的白菜和甘藍均存在和擬南芥另外3個WRI1 基因拷貝相似的基因序列，而甘藍型油菜含有A 組和C 組2 種基因型的染色體，由此推測甘藍型油菜也可能存在不同的WRI1 基因拷貝，并且有不同的基因組來源，對脂肪酸合成調控作用也可能各有不同；因此，獲得并區(qū)分能高效提高含油量的WRI1 基因具有重要的現(xiàn)實意義。限制性內切酶Bcl I 的酶切結果不僅證實了突變位點的真實存在，還為區(qū)分甘藍型油菜AtWRI1–Like WRI1 基因的A和C 基因組的來源提供了新的方法。然而，對基因功能的研究還需進一步利用轉基因手段來驗證。WRI1 基因的克隆和序列分析將對甘藍型油菜該轉錄因子的研究提供素材，并為進一步的轉基因研究和應用打下基礎。

[1]Rogalski M，Carrer H．Engineering plastid fatty acid biosynthesis to improve food quality and biofuel production in higher plants[J]．Plant Biotechnology Journal，2011，9(5)：554–564．

[2]夏晗，王興軍，李孟軍，等．利用基因工程改良植物脂肪酸和提高植物含油量的研究進展[J]．生物工程學報，2010，26(6)：735–743．

[3]Meinke D W，F(xiàn)ranzmann L H，Nickle T C，et al．Leafy cotyledon mutants of Arabidopsis[J]．The Plant Cell Online，1994，6(8)：1049–1064．

[4]Stone S L，Kwong L W，Yee K M，et al．LEAFY COTYLEDON2 encodes a B3 domain transcription factor that induces embryo development[J]．Proceedings of the National Academy of Sciences ， 2001 ， 98(20) ：11806–11811．

[5]Gazzarrini S，Tsuchiya Y，Lumba S，et al．The transcription factor FUSCA3 controls developmental timing in Arabidopsis through the hormones gibberellin and abscisic acid[J]．Developmental Cell，2004，7(3)：373–385．

[6]Cernac A，Andre C，Hoffmann-Benning S，et al．WRI1 is required for seed germination and seedling establishment[J]. Plant Physiology，2006，141(2)：745– 757．

[7]Parcy F，Valon C，Raynal M，et al．Regulation of gene expression programs during Arabidopsis seed development：Roles of the ABI3 locus and of endogenous abscisic acid[J]．The Plant Cell Online，1994，6(11)：1567–1582．

[8]Santos-Mendoza M，Dubreucq B，Baud S，et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis[J]．The Plant Journal，2008，54(4)：608–620．

[9]Focks N，Benning C．Wrinkled1：A novel，low-seed-oil mutant of Arabidopsis with a deficiency in the seed- specific regulation of carbohydrate metabolism[J]. Plant Physiology，1998，118(1)：91–101．

[10]Masaki T，Mitsui N，Tsukagoshi H，et al．Activator of spomin：LUC1/WRINKLED1 of Arabidopsis thaliana transactivates sugar-inducible promoters[J]．Plant and Cell Physiology，2005，46(4)：547–556．

[11]Baud S，Mendoza M S，To A，et al．WRINKLED1 specifies the regulatory action of LEAFY COTYLED- ON2 towards fatty acid metabolism during seed maturation in Arabidopsis[J]．The Plant Journal，2007，50(5)：825–838．

[12]Maeo K，Tokuda T，Ayame A，et al．An AP2 type ‐transcription factor，WRINKLED1，of Arabidopsis thaliana binds to the AW-box sequence conserved among proximal upstream regions of genes involved in fatty acid synthesis[J]．The Plant Journal，2009，60(3)：476–487．

[13]To A，Joubès J，Barthole G，et al．WRINKLED transcription factors orchestrate tissue-specific regulation of fatty acid biosynthesis in Arabidopsis[J]．The Plant Cell Online，2012，24(12)：5007–5023．

[14]柴國華，白澤濤，蔡麗，等．油菜基因 BnWRI1 的克隆及 RNAi 對種子含油量的影響[J]．中國農業(yè)科學，2009，42(5)：1512–1518．

[15]Shen B，Allen W B，Zheng P，et al．Expression of ZmLEC1 and ZmWRI1 increases seed oil production in maize[J]．Plant Physiology，2010，153(3)：980–987．

[16]Pouvreau B，Baud S，Vernoud V，et al．Duplicate maize wrinkled1 transcription factors activate target genes involved in seed oil biosynthesis[J]．Plant Physiology，2011，156(2)：674–686．

[17]官春云，王國槐．油菜品質育種的研究Ⅱ.雙低油菜湘油 11 號的選育[J]．湖南農業(yè)大學學報(原湖南農學院學報)：自然科學版，1989，15(2)：20–24．

[18]陳社員，官春云．雙低油菜品種湘油 13 號選育及品種特性研究[J]．湖南農業(yè)大學學報：自然科學版，1998，24(4)：277–281．

[19]陳社員，官春云，王國槐，等．雙低油菜新品種湘油 15 號的選育[J]．湖南農業(yè)大學學報：自然科學版，2003，29(2)：103–105．

[20]侯國佐，杜才富，侯燕，等．“三高兩低”雜交油菜油研九號的選育與推廣應用[J]．貴州農業(yè)科學，2009，37(2)：1–4．

[21]魯坤存，劉淑艷，郭家保，等．芥甘雜交選育甘藍型黃籽油菜的研究[J]．湖南農業(yè)大學學報：自然科學版，2006，32(2)：116–119．