李思聰，曾富強(qiáng)，聶 健，王 斌，李金良，李旭廷

（四川省畜牧科學(xué)研究院獸藥研究所，四川 成都 610066）

在我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)中，抗生素一直是防治畜禽細(xì)菌性感染疾病的首選，抗生素的長(zhǎng)期使用雖然在防治細(xì)菌性疾病中起了重要作用，但是所帶來(lái)的藥物殘留及耐藥性等危害已日趨嚴(yán)重，給當(dāng)今規(guī)模化安全養(yǎng)殖和人類健康帶來(lái)了嚴(yán)重威脅。中藥屬于純天然藥物，其毒性低，不會(huì)造成嚴(yán)重的藥物殘留，不易產(chǎn)生耐藥性；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)利用中草藥及其提取物可以發(fā)揮直接殺滅病原菌或通過(guò)提高機(jī)體免疫力達(dá)到防治疾病的效果，這為我國(guó)傳統(tǒng)中藥替代抗生素防治細(xì)菌性疾病奠定了良好的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)選用連翹等7味中藥，對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離耐藥株進(jìn)行了體外抑菌作用研究，旨在篩選出對(duì)臨床耐藥菌株有抑菌作用的藥物，為指導(dǎo)中藥在臨床上的正確使用，逆轉(zhuǎn)臨床耐藥菌株的耐藥性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥 赤芍、白術(shù)、穿心蓮、莪術(shù)、秦艽、連翹、知母，購(gòu)自成都市德仁堂中藥店，經(jīng)四川某動(dòng)物藥業(yè)有限責(zé)任公司中藥檢驗(yàn)室的顯微鏡檢和薄層色譜鑒定，表明均為合格品。

1.1.2 試驗(yàn)菌株 標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌ATCC25923，大腸埃希菌ATCC25922；臨床分離菌株：耐藥金黃色葡萄球菌LQ1007SA-5（分離自成都地區(qū)奶牛乳房炎病例），耐藥大腸埃希菌AY1106EC-2（分離自安岳縣仔豬臨床腹瀉病例），于四川省畜牧科學(xué)研究院獸藥研究所保存。

1.1.3 儀器與試劑 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52（上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)），高壓滅菌釜MLS-3750（產(chǎn)自日本三洋公司），凈化工作臺(tái)（成都紅光空調(diào)凈化設(shè)備制造公司生產(chǎn)），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn)），游標(biāo)卡尺，微量移液器（芬蘭Finnpipette公司生產(chǎn)），玻璃涂布棒；N-甲基吡咯烷酮（NMP），營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯（杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)），慶大霉素藥敏紙片（10μg/片）、青霉素 G 藥敏紙片（10μg/片），均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥液的制備 取粉碎后的中草藥100g于1000mL 65%乙醇水溶液中，室溫浸泡30min后煎煮1h，稍加冷卻后過(guò)濾得到初煎液；在剩余藥渣中加入800mL 65%乙醇，煮沸1h，合并兩次煎液，減壓蒸餾濃縮至100mL，即制得提取物。提取物經(jīng)10000r/min離心5min，取上清液灌裝于5mL抗生素專用玻璃瓶中，即得1g/mL中藥上清液；于沉淀中加入等量NMP溶解，就可制成1g/mL中藥沉淀溶液，然后灌裝于5mL抗生素專用玻璃瓶中。將上清液和沉淀溶液分別在121℃下滅菌25min，于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液的制備 將大腸埃希菌ATCC25922等2株標(biāo)準(zhǔn)株和大腸埃希菌AY1106EC-2等2株臨床分離株在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)后，又挑取單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)12～16h，作為原菌液。

1.2.3 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備 將滅菌后的營(yíng)養(yǎng)瓊脂傾注至無(wú)菌干燥平皿上（約20mL），待培養(yǎng)基冷卻后將其置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行24h無(wú)菌檢測(cè)，用密封口袋封裝于4℃冰箱中備用，7d內(nèi)用完。

1.2.4 抑菌試驗(yàn) 采用管碟法。用微量移液器吸取濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏募?xì)菌稀釋液（1.5×108cfu/mL）100 μ至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，立即用無(wú)菌玻璃涂布棒均勻涂布，然后用無(wú)菌鑷子將鋼管均勻擺放在平板上，靜置10～15min，滴加受試藥液至液面與鋼管表面平行。將平板置于37℃下培養(yǎng)12～18h后，采用“十字交叉法”測(cè)定抑菌圈大小。

1.2.5 抑菌圈結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 參照《中藥藥理學(xué)》抑菌圈結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑≥20mm為高度敏感，10 19mm為中度敏感，＜10mm為不敏感。

2 結(jié)果

2.1 7種中藥提取物對(duì)大腸埃希菌的抑菌效果 由表1可知，在大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株的抑菌試驗(yàn)中，7味中藥提取物沉淀部分的抑菌效果與慶大霉素相當(dāng)，抑菌圈直徑在19.86～22.84mm之間。在大腸埃希菌臨床株的抑菌試驗(yàn)中，連翹、赤芍、白術(shù)、知母沉淀部分的抑菌效果優(yōu)于慶大霉素，抑菌圈直徑在18.58～22.28mm之間?？傮w上看，受試7味中藥沉淀部分的抑菌效果較好，且均優(yōu)于各自上清液的抑菌效果。

表1 中藥提取物對(duì)大腸埃希菌的抑菌效果mm

2.2 7種中藥提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果 由表2可知，在金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株的抑菌試驗(yàn)中，味中藥提取物的抑菌效果不如青霉素。在金黃色葡萄球菌臨床耐藥株的抑菌試驗(yàn)中，連翹、赤芍提取物的抑菌效果優(yōu)于青霉素，抑菌圈直徑在24.94～26.60mm之間總體上看，7味中藥提取物對(duì)臨床耐藥金葡菌的抑菌效果要好于標(biāo)準(zhǔn)金葡菌，且沉淀部分的抑菌效果要優(yōu)于各自的上清液。

表2 中藥提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果 mm

3 討論

3.1 不同提取條件對(duì)抗菌效果的影響 不同提取條件對(duì)中藥抗菌成分提取率的影響非常廣泛。應(yīng)用于中藥提取物生產(chǎn)的溶劑主要有水、乙醇及兩者的混合物，但中藥抗菌成分復(fù)雜，無(wú)論選用水提醇沉法還是醇提水沉法均會(huì)產(chǎn)生大量沉淀，被當(dāng)成無(wú)用物質(zhì)除去。本項(xiàng)研究選擇水醇混合溶劑進(jìn)行煎煮提取，最大限度地促進(jìn)中藥有效成分的溶出提取，在蒸發(fā)濃縮階段除收取上清液外，對(duì)濃縮過(guò)程產(chǎn)生的沉淀用無(wú)抗菌活性的N-甲基吡咯烷酮進(jìn)行復(fù)溶，同時(shí)測(cè)定上清液和沉淀物的抗菌效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，多數(shù)受試中藥提取后沉淀物的抗菌效果優(yōu)于上清液，可以推測(cè)出抗菌活性物質(zhì)應(yīng)多為極性小的醇溶性物質(zhì)，這為進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)活性成分的分離鑒定起到了指示作用。

3.2 中藥提取物對(duì)耐藥菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌效果 受試的臨床大腸埃希菌（AY1106EC-2）分離自四川仔豬腹瀉病例，與標(biāo)準(zhǔn)大腸埃希菌株相比，前者降低了對(duì)慶大霉素的敏感性。但在本次試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，連翹、赤芍白術(shù)、知母沉淀部分的抑菌效果優(yōu)于慶大霉素，并且與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，中藥對(duì)臨床菌的抑菌圈更大，顯示出中藥提取物的抑菌機(jī)制不受耐藥菌通常的耐藥機(jī)制影響受試的臨床耐藥金黃色葡萄球菌（LQ1007SA-5）分離自成都周邊奶牛場(chǎng)奶牛乳房炎病例，在前期耐藥性測(cè)試中表現(xiàn)出明顯的多重耐藥性，耐藥基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其含有mecA基因，該基因負(fù)責(zé)編碼的青霉素結(jié)合蛋白2α能降低青霉素的結(jié)合，維持金葡菌細(xì)胞壁的正常功能，達(dá)到對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的效果。在受試的7種中藥中，多數(shù)表現(xiàn)出較好的抑菌效果，其中赤芍和連翹提取物對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果接近甚至優(yōu)于抗生素。特別是赤芍和連翹提取物的沉淀部分，對(duì)臨床耐藥金葡菌的抑菌效果顯著優(yōu)于青霉素但在標(biāo)準(zhǔn)金葡菌抑菌試驗(yàn)中，效果明顯不及青霉素這說(shuō)明中藥對(duì)耐藥金葡菌的作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)或許不同于β-內(nèi)酰胺類抗生素，有可能增加了抗菌活性物質(zhì)與耐藥金葡菌細(xì)胞壁靶蛋白的結(jié)合能力，進(jìn)而破壞金葡菌細(xì)胞壁的合成，增加其對(duì)中藥抑菌物質(zhì)的敏感性，達(dá)到提高抑菌效果的目的。其內(nèi)在作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

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