韓曉紅，李 磊，段春紅

（武漢生物工程學院 生物工程系，湖北 武漢430415）

1 引言

紅豆杉（Taxus）是紅豆杉科（Taxaceae）紅豆杉屬（Taxus）植物的總稱[1]，從中提取的紫杉醇以其獨特的治癌機理和療效顯著而風靡全球，從而促成了世界性開發(fā)紅豆杉和提取紫杉醇的新潮流。全球共有11種紅豆杉，分布于北半球的溫帶及亞熱帶地區(qū)，在我國有4個品種及1個變種：東北紅豆杉（T.cuspidata）、云南紅豆杉（T.yunnanensis）、西藏紅豆杉（T.wallichiana）、中國紅豆杉 （T.chinensi）、南 方 紅豆 杉 （T.chinensis varmairei），其中中國紅豆杉和南方紅豆杉為我國所特有[2]。

由于紅豆杉生長極其緩慢，種子存在休眠與后熟難以繁殖，內(nèi)生菌種類與數(shù)量多，愈傷組織易褐變及生長不穩(wěn)定和紫杉醇市場需求大、利潤高，因此通過體外植物組織培養(yǎng)獲得試管苗運用于觀賞盆景、工業(yè)木材和細胞懸浮培養(yǎng)高產(chǎn)紫杉醇都有巨大的科研、商業(yè)前景。本試驗以南方紅豆杉的嫩莖為外植體，探討了不同激素組合和濃度對愈傷化誘導及其愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)的影響，為生產(chǎn)紅豆杉試管苗和實現(xiàn)紫杉醇工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的技術(shù)參考。

2 材料與方法

南方紅豆杉無菌嫩莖由武漢生物工程學院植物細胞工程實驗室提供。

2.1 不同激素對于紅豆杉愈傷組織誘導影響試驗

截取無菌嫩莖1cm左右，以B5＋蔗糖20g/L＋瓊脂8g/L＋AC1g/L＋酪蛋白1g/L為基礎培養(yǎng)基，添加激素2，4－D、6－BA和 NAA（組合見表1），探求其對嫩莖愈傷化的影響，每只試管接種1個莖段，每個處理重復16次。觀察統(tǒng)計30d和60d后的愈傷化誘導情況，計算愈傷組織誘導率和褐化率。其中，愈傷組織誘導率＝（愈傷化總數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%，褐變率＝（褐變數(shù)/愈傷化的外植體總數(shù)）×100%。

表1 紅豆杉愈傷組織誘導的激素設計

2.2 不同激素對紅豆杉愈傷組織細胞繼代增殖影響

2.2.1 探討NAA對愈傷組織繼代增殖的影響

在試驗基礎上，提高NAA濃度，并搭配KT0.5mg/L，選 用 NAA3.0mg/L、NAA4.0mg/L、NAA5.0mg/L分別進行愈傷誘導試驗，基礎培養(yǎng)基為B，5（去掉 Cu2＋的 B5培養(yǎng)基）＋AC0.5g/L＋酪蛋白1g/L＋蔗糖20g/L＋瓊脂8g/L，每個處理接種愈傷組織16只試管，培養(yǎng)30d觀察愈傷生長情況并稱其鮮重，并計算愈傷組織生長值和愈傷組織生長指數(shù)。其中，愈傷組織生長值（mg）＝收獲鮮重－接種鮮重，愈傷組織生長指數(shù)＝（收獲鮮重－接種鮮重）/接種鮮重。

2.2.2 探討KT對愈傷組織增殖培養(yǎng)的影響

在試驗確定NAA濃度基礎上，設計KT濃度梯度KT0mg/L，KT0.5mg/L，KT1.0mg/L，從而確定對于紅豆杉愈傷組織增殖的最佳KT濃度?；A培養(yǎng)基為B，5（去掉Cu2＋的B5培養(yǎng)基）＋AC0.5g/L＋酪蛋白1g/L＋蔗糖20g/L＋瓊脂8g/L，每個處理重復16次，培養(yǎng)30d稱其鮮重，計算愈傷組織生長指數(shù)。

3 結(jié)果分析

3.1 不同激素對于紅豆杉愈傷組織誘導的影響

選用不同濃度的2，4－D與6－BA組合、NAA與6－BA組合進行嫩莖愈傷化誘導試驗，統(tǒng)計其30 d、60 d的誘導率及褐變率（表2）。

表2 激素對紅豆杉嫩莖誘導愈傷組織的影響

由表2可知，2號培養(yǎng)基（2，4－D2.0mg/L＋6－BA0.5mg/L）中愈傷組織誘導率達到100%，褐變率較低，比較適合誘導紅豆杉嫩莖的愈傷化。比較兩組激素搭配，可見生長素2，4－D比NAA誘導愈傷化的作用效果更明顯（圖1），但高濃度的2，4－D容易導致褐變，因此誘導紅豆杉嫩莖愈傷化的最佳激素組合為：2，4－D2.0mg/L＋6－BA0.5mg/L。

圖1 愈傷化的嫩莖（2，4－D2.0＋6－BA0.5）

3.2 不同激素對紅豆杉愈傷組織繼代增殖影響

3.2.1 NAA對于紅豆杉愈傷組織增殖的影響

由誘導試驗可知愈傷組織長期處于2，4－D的培養(yǎng)基上易褐化和引起細胞癌變；同時相對于6－BA，KT對減輕褐化有更明顯的效果[3]，且由表2可知低濃度的NAA（NAA1.0和NAA2.0）對促進外植體愈傷化沒有明顯的效果，因此以B，5（去掉Cu2＋的B5培養(yǎng)基）＋AC0.5g/L＋酪蛋白1g/L＋蔗糖20g/L＋瓊脂8g/L為基礎培養(yǎng)基，添加較高濃度的NAA（濃度梯度為：NAA3.0mg/L、NAA4.0mg/L、NAA5.0mg/L），同時搭配KT0.5mg/L進行愈傷組織的增殖試驗，30 d后對增殖結(jié)果進行統(tǒng)計，其生長指數(shù)見表3。

表3 NAA對愈傷組織增殖的影響

培養(yǎng)30d后，在NAA濃度為4.0mg/L時，愈傷組織增殖效果最好（圖2），平均生長值達到2.322g，由此可知NAA濃度在4.0mg/L時是南方紅豆杉愈傷組織增殖的最佳濃度。

圖2 增殖培養(yǎng)的愈傷組織

3.2.2 KT對紅豆杉愈傷組織增殖的影響

在篩選出增殖的最佳NAA濃度的基礎上，探求不同濃度的 KT（KT 的濃度梯度為：0mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L）對愈傷組織增殖培養(yǎng)的影響，培養(yǎng)一個月后觀察愈傷組織增值情況并稱重，其生長指數(shù)結(jié)果見表4。其中當KT濃度為0.5mg/L時，愈傷組織增殖效果最好，生長指數(shù)可達0.983±0.030，由此可知KT濃度為0.5mg/L時，愈傷組織增殖效果最好。

表4 KT對愈傷組織繼代培養(yǎng)影響試驗結(jié)果

4 結(jié)語

盛長忠等[4]研究發(fā)現(xiàn)，2，4－D比 NAA更有利于愈傷組織的形成，以2.0mg/L時效果最好。培養(yǎng)基中添加CA（酪蛋白）、PHE和乙酸鈉能促進愈傷組織生長和紫杉醇積累，其中CA0.5mg/L時生長量最大。李斌連等[5]認為，從芽誘導出來的愈傷組織顏色較淺，出愈時間較早，而從莖段和葉片誘導出的愈傷組織顏色濃綠，以后繼代過程中易發(fā)生褐化，因此，側(cè)芽是誘導愈傷組織最佳的外植體。低濃度的CA（酪蛋白，0.1%～0.5%）能參與細胞分裂和生長的代謝活動，促進愈傷組織的生長，濃度較高時，不僅抑制天然氨基酸的正常合成，而且CA中過量的芳香族氨基酸進入次級代謝途徑，產(chǎn)生許多酚類物質(zhì)，使愈傷組織褐化，抑制其生長[6]。本試驗以嫩莖為外植體，愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基為：B5＋2，4－D2.0mg/L＋6－BA0.5mg/L＋蔗糖20g/L＋瓊脂8g/L＋AC1g/L＋酪蛋白1g/L；繼代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為：B，5（去掉 Cu2＋的B5培養(yǎng)基）＋NAA4.0mg/L＋KT0.5mg/L＋蔗糖20g/L＋瓊脂8g/L＋AC0.5g/L＋酪蛋白1g/L。獲得穩(wěn)定的愈傷組織是工業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇的關(guān)鍵所在，在試驗過程中發(fā)現(xiàn)較高濃度的2，4－D能短時間內(nèi)誘導外植體愈傷化，但在其上面繼續(xù)培養(yǎng)便很快褐化、死亡。如果把2，4－D培養(yǎng)基上剛形成的愈傷化細胞團立即轉(zhuǎn)移到較高濃度的NAA培養(yǎng)基上便能防止細胞褐化，以后每隔一個月左右繼代一次便可使愈傷組織持續(xù)穩(wěn)定生長，便可獲得穩(wěn)定的愈傷組織，為實際生產(chǎn)提供了一定的技術(shù)參考。

[1]梁珍海，劉根林，徐 鋒.紅豆杉屬植物組織培養(yǎng)及其快速繁殖研究綜述[J].江蘇林業(yè)科技，2001，28（3）：45～47.

[2]包維楷，陳慶恒.中國的紅豆杉資源及其開發(fā)研究現(xiàn)狀與發(fā)展對策[J].自然資源學報，1998，13（4）：375～380.

[3]王 水，賈勇炯，魏 峰，等.云南紅豆杉的組織培養(yǎng)及植株再生[J].云南植物研究，1997，19（4）：407～410.

[4]盛長忠，王淑芳.南方紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)研究[J].中草藥，2000，31（2）：57～59.

[5]李斌連，邱 萃，劉金仙，等.南方紅豆杉愈傷組織誘導和繼代培養(yǎng)體系的建立[J].福建農(nóng)林大學學報，2006，35（5）：515～518.

[6]甘煩遠，鄭光植.紅豆杉細胞培養(yǎng)的研究[J].云南植物研究，1996，18（2）：134～138.