郝建安，楊 波，姜天翔，張秀芝，張曉青，張愛君，王 靜，張雨山

（國家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192）

一種用于海水處理的微生物絮凝劑ETYBF

郝建安，楊 波，姜天翔，張秀芝，張曉青，張愛君，王 靜，張雨山*

（國家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192）

自渤海灣分離到一株對(duì)海水有高絮凝活性的菌株，鑒定并命名為黑曲霉ETYB-13。該菌株發(fā)酵上清液經(jīng)乙醇沉淀與冷凍真空干燥，獲得微生物絮凝劑ETYBF。該菌株的絮凝活性曲線證實(shí)，在培養(yǎng)48～72 h之間，是收集絮凝劑的最佳時(shí)間。化學(xué)定性實(shí)驗(yàn)顯示，ETYBF的主要成分為多糖。紫外光譜與紅外光譜也確定ETYBF主要成分為多糖。凝膠滲透色譜(GPC)證實(shí)，ETYBF是一種混合物，且分子量在105Da以上。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ETYBF的活性不受環(huán)境溫度與pH變化的影響。

海水水質(zhì)處理；微生物絮凝劑ETYBF；多糖

絮凝劑是一類常用的水處理試劑，可以將水中的固體、膠體以及微生物等沉降，從而達(dá)到凈水要求。截至目前，已開發(fā)出多種絮凝劑，無機(jī)絮凝劑與有機(jī)絮凝劑是主要的絮凝劑類型。然而，無機(jī)絮凝劑與有機(jī)絮凝劑在使用中都發(fā)現(xiàn)了一些問題，如殘留離子，易引起“三致”效應(yīng)等。鑒于這兩種絮凝劑存在的缺點(diǎn)，生物絮凝劑，這種被認(rèn)為安全、無污染的新型絮凝劑成為研究的熱點(diǎn)[1]。

微生物絮凝劑是由微生物產(chǎn)生的一種生物絮凝劑，是最具應(yīng)用價(jià)值的生物絮凝劑。1986年，日本學(xué)者Ryuichiro等發(fā)現(xiàn)了紅平紅球菌（Rhodococcus erythropolis）可產(chǎn)微生物絮凝劑NOC-1，可對(duì)水中的有機(jī)與無機(jī)成分有絮凝作用[2]。2003年，Deng等自土壤樣品中分離到具備絮凝活性的膠質(zhì)芽孢桿菌，該菌株可以產(chǎn)生微生物絮凝劑MBFA9。MBFA9在0.1 mL/L的濃度下就可對(duì)高嶺土懸液獲得99.6%的絮凝率[3]。2005年，Deng等再次報(bào)道了寄生曲霉可以產(chǎn)生微生物絮凝劑，該絮凝劑可以對(duì)水溶性染料產(chǎn)生高絮凝活性[4]。2007年，Yim等發(fā)現(xiàn)一種溝鞭藻類，螺旋藻KG03可以產(chǎn)生具有絮凝活性的胞外多糖[5]。陸續(xù)報(bào)道的具有絮凝活性的微生物已經(jīng)涵蓋細(xì)菌、真菌以及藻類等。微生物絮凝劑在很多行業(yè)都有較大的應(yīng)用潛力。

近年來，海水利用已經(jīng)成為新興的產(chǎn)業(yè)。海水水質(zhì)決定了海水利用的效率。絮凝劑在海水水質(zhì)處理中的應(yīng)用必不可少。雖然市面上有較多絮凝劑，但專用于海水處理的微生物絮凝劑還沒有，關(guān)于黑曲霉產(chǎn)生用于海水處理的微生物絮凝劑還未見報(bào)道。

本文研究了一種分離自黑曲霉ETYB-13，對(duì)海水具有絮凝活性的微生物絮凝劑。我們研究了該菌株的絮凝活性分布與絮凝活性曲線，并通過乙醇沉淀與冷凍真空干燥將該絮凝活性成分制成粉末狀微生物絮凝劑ETYBF，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了研究。

1 試驗(yàn)部分

1.1 菌種

原始水樣采集自渤海灣，菌種通過梯度稀釋法與劃線法分離。通過絮凝活性檢測(cè)來篩選絮凝活性菌株。

1.2 培養(yǎng)基

真菌培養(yǎng)基∶葡萄糖20 g，酵母抽提物0.5 g，NH4Cl 0.8 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO42 g，CaCl20.5 g，蒸餾水補(bǔ)足 1 L，pH 7.0，115℃，25 min。

1.3 絮凝活性檢測(cè)

絮凝活性試驗(yàn)采用改進(jìn)的高嶺土法[6]，在150 mL的燒杯中加入93 mL陳海水，0.4 g高嶺土，5 mL1%(W/V)CaCl2溶液以及2 mL培養(yǎng)液。200 r/min攪拌2 min，靜置5 min，測(cè)定其上清液在波長550 nm處的吸光度(以A表示)。同時(shí)以蒸餾水代替培養(yǎng)液進(jìn)行絮凝活性試驗(yàn)，其上清液在550 nm處的吸光度（以B表示）為對(duì)照。

絮凝率 =（B-A）/B×l00%。

1.4 菌種鑒定

真菌菌株基因組的提取參照Weiland所述方法[7]，選用通用引物NS1 5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'和NS8 5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3'[13]擴(kuò)增18S rRNA基因。PCR 反應(yīng)體系（25 uL）：基因組 DNA 2 uL，引物各 10 pmol，10×PCR Buffer2.5 uL，Mg2+1.5 uL，dNTP2 uL，rTaq 3uL，ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)條件：95 ℃，5 min；94 ℃，1 min，54 ℃，1 min，72 ℃，2 min，30 cycle；72 ℃，10 min；4 ℃ pause。PCR 產(chǎn)物純化回收，與pMD18-T載體連接（16℃過夜）。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選，PCR鑒定。陽性克隆子委托上海生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中比對(duì)分析。形態(tài)學(xué)觀察為平板培養(yǎng)形態(tài)觀察結(jié)合顯微鏡下觀察。

1.5 絮凝活性定位

接種菌種于100mL液體培養(yǎng)基，30℃，180rpm培養(yǎng)48h；收集培養(yǎng)物。此時(shí)的培養(yǎng)物既含有細(xì)胞也含有發(fā)酵產(chǎn)物，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)保留部分。培養(yǎng)物經(jīng)4℃，12 000 rpm，離心30 min，進(jìn)行固液分離，此時(shí)獲得的液體即發(fā)酵上清液，已經(jīng)除去了原有的細(xì)胞，只含有發(fā)酵產(chǎn)物。收集菌體，用10 mMTris.HCl(pH8.0)溶液反復(fù)清洗后重新溶解，形成細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液在功率500 W，以10 s為間隔，超聲破碎30 min，于4℃，12 000 rpm，離心10 min，去除沉淀，所獲得的細(xì)胞破碎產(chǎn)物溶液只包含細(xì)胞成分不包括發(fā)酵產(chǎn)物。培養(yǎng)物，發(fā)酵上清液，細(xì)胞破碎產(chǎn)物進(jìn)行絮凝活性檢測(cè)。

1.6 絮凝活性曲線

5 mL液體培養(yǎng)基活化菌種，30℃，180 rpm培養(yǎng)24 h。取20支試管，每管中含5 mL液體培養(yǎng)基，按1∶100比例接種菌液，30℃，180 rpm培養(yǎng)。每隔24 h，取2 mL培養(yǎng)物，4℃，12 000 rpm，離心5 min，所得上清液進(jìn)行絮凝活性檢測(cè)，記錄絮凝率。剩余3 mL培養(yǎng)物，4℃，12 000 rpm，離心10 min除去發(fā)酵液，稱重，記錄數(shù)據(jù)作為生物量。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，以生物量和絮凝率為縱軸，繪制絮凝活性曲線。

1.7 ETYBF的制備

接種菌種于500 mL液體培養(yǎng)基，30℃，180 rpm，振蕩培養(yǎng)48～72 h，培養(yǎng)物經(jīng)過濾除去菌絲體。4℃，12 000 rpm，離心30 min進(jìn)行固液分離，收集發(fā)酵上清液。在0℃條件下，向發(fā)酵上清液中加入2倍體積冰乙醇，輕微攪拌混勻。此溶液冰浴靜置3 h后，4℃，12 000 rpm，離心10 min，保留沉淀。沉淀控干并溶于5 mL雙蒸水中，冷凍真空干燥即獲得微生物絮凝劑ETYBF。

1.8 ETYBF成分分析

進(jìn)行糖類（Molish反應(yīng)，蒽酮反應(yīng)）、蛋白類（茚三銅反應(yīng)，雙縮脲反應(yīng)）、脂類（蘇丹III染色）、以及核酸類（苔黑酚反應(yīng)，二苯胺反應(yīng)）定性反應(yīng)，初步確定絮凝活性物質(zhì)種類。

在190～500 nm進(jìn)行紫外掃描，4 000～400 cm-1進(jìn)行紅外掃描，驗(yàn)證定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.9 ETYBF分子量的確定

ETYBF溶于雙蒸水，使用0.45 μm濾膜過濾。反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)壓力為1.5 MPa。樣品注入流速為0.5 mL/min。所用柱子為TosohTSKgelG4000PWXL，7.8mm×300mm。標(biāo)準(zhǔn)品為 BlueDextran(MW＞2×106)：Dextran T-70，Dextran T-40。

1.10 ETYBF穩(wěn)定性研究

取粉末狀絮凝活性產(chǎn)物，配成2 mg/mL溶液，進(jìn)行絮凝活性試驗(yàn)。將反應(yīng)環(huán)境pH在2～12范圍內(nèi)以1為間隔調(diào)節(jié)，觀察絮凝活性變化。將反應(yīng)環(huán)境溫度在0℃、20℃、30℃、37℃、65℃、80℃、100℃條件下改變，觀察絮凝活性變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑曲霉ETYB-13的分離與鑒定

通過稀釋法、平板劃線法與絮凝活性篩選，發(fā)現(xiàn)真菌ETYB-13絮凝率一直在80%左右，活性較高且穩(wěn)定，因此選取此株菌作為后續(xù)試驗(yàn)的研究對(duì)象。ETYB-13菌株的18S rDNA擴(kuò)增出約1 728 bp長的片段，在Genbank中的比對(duì)結(jié)果見表1。

表1 ETYB-13 18S rRNA在Genbank數(shù)據(jù)庫中比對(duì)分析

18 S rRNA是真核生物核糖體40S亞基的組成部分，其進(jìn)化速率較慢，因此是作為菌種鑒定較好的分子標(biāo)尺[8]。ETYB-13的18S rRNA基因序列在Genbank中比對(duì)后發(fā)現(xiàn)其與Aspergillus niger D63697.1菌株的相似性最大，達(dá)到99%。菌株ETYB-13 18S rDNA在Genbank中的注冊(cè)號(hào)為GQ903338。

將ETYB-13在固體平板上進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果見圖1。

ETYB-13在固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)36～48 h后，菌落初具規(guī)模。菌落初期白色，然后變?yōu)辄S色。菌落外觀干燥，不透明，呈現(xiàn)較疏松的絲絨狀，中央凸起，有放射狀溝紋。菌落與培養(yǎng)基間的連接緊密，不易挑起。生長后期，孢子囊呈黑色粒狀，菌落背面呈淡黃色，菌落周圍出現(xiàn)透明圈。在顯微鏡下，ETYB-13菌株分生孢子梗直立生長，無隔，不分枝，淡褐色，粗糙，頂端膨大成近球形的泡囊，黑褐色。表面長滿小梗，黑色。分生孢子呈橢圓形或近圓形，著生于小梗頂端，串生。

結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，最終確定ETYB-13菌株為黑曲霉，命名為黑曲霉 ETYB-13（Aspergillus niger ETYB-13）。

2.2 絮凝活性定位

培養(yǎng)物，發(fā)酵上清液，細(xì)胞破碎產(chǎn)物進(jìn)行絮凝活性檢測(cè)，結(jié)果見圖2。

圖2顯示，黑曲霉培養(yǎng)物與發(fā)酵上清液的絮凝活性均達(dá)80%以上，而細(xì)胞破碎產(chǎn)物的絮凝活性低于10%，因此可以肯定該菌株產(chǎn)生的絮凝活性產(chǎn)物主要存在于發(fā)酵上清液中。

微生物絮凝劑的來源主要有兩類，一類來自于微生物本身，某些細(xì)菌、霉菌、放線菌和酵母等本身就可以產(chǎn)生絮凝效果，從微生物細(xì)胞壁也可以提取絮凝劑，如葡聚糖、蛋白質(zhì)和N-乙酰葡萄糖胺等成分。另一類來自于微生物細(xì)胞代謝產(chǎn)物，此類成分范圍較廣，包括多糖、多肽、蛋白質(zhì)、脂類及其復(fù)合物等[9]。本研究發(fā)現(xiàn)該菌的絮凝活性主要存在于發(fā)酵上清液中，可以判斷其絮凝活性成分是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，這為后續(xù)絮凝活性成分的提取提供了依據(jù)。

2.3 絮凝活性曲線

以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以絮凝率和生物量為縱坐標(biāo)，繪制黑曲霉ETYB-13絮凝活性曲線，結(jié)果見圖3。

圖3顯示，菌株生長狀態(tài)與絮凝活性幾乎同步，78 h菌株生物量最大，證明其生長達(dá)到頂峰。培養(yǎng)時(shí)間在48～72 h之間，菌株絮凝率都在90%以上，其中培養(yǎng)54 h，菌株絮凝率最高達(dá)到94.3%。

真菌在延滯期中，由于剛剛接種到培養(yǎng)基，其代謝系統(tǒng)需要適應(yīng)新的環(huán)境，同時(shí)要合成酶、輔酶、其他代謝中間代謝產(chǎn)物等，所以此時(shí)期，生長速率常為零，也沒有活性代謝產(chǎn)物產(chǎn)生。進(jìn)入快速生長期，經(jīng)過調(diào)整期的準(zhǔn)備，此時(shí)期的真菌生長已具備足夠的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)外界環(huán)境也是最佳狀態(tài)。真菌生長速率最快，代謝旺盛，酶系活躍，產(chǎn)生大量活性代謝產(chǎn)物。進(jìn)入生長衰退期，外界環(huán)境對(duì)真菌的繼續(xù)生長越來越不利，細(xì)胞的分解代謝大于合成代謝。大量微生物死亡，死亡速度大于新生速度，整個(gè)群體出現(xiàn)負(fù)增長，細(xì)胞開始畸形，自溶死亡，活性代謝產(chǎn)物亦隨之消亡。

2.4 ETYBF成分分析

定性實(shí)驗(yàn)顯示，除molish反應(yīng)與蒽酮反應(yīng)為陽性以外，其他反應(yīng)均為陰性，因此可初步確定ETYBF的主要成分為多糖。紫外光譜掃描顯示，ETYBF的最大吸收峰在201 nm，此處是某些多糖的特征吸收峰。紅外光譜掃描顯示，ETYBF有兩組峰。在3 284 cm-1附近的寬峰代表了羥基基團(tuán)；在1 000～1 100 cm-1附近的一系列吸收峰是某些糖類衍生物的特征峰。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可判定ETYBF的活性成分為多糖。

微生物絮凝活性產(chǎn)物，主要為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高分子物質(zhì)，大多為多糖類和蛋白質(zhì)類物質(zhì)。如Alcaligenes cupidus KT201代謝產(chǎn)生的Al-201即是一種由葡萄糖、乳糖、葡萄醛酸和乙酸(摩爾比為 6.34∶5.55∶1.0)組成的微生物絮凝劑。Enterobacter sp.BY-29所產(chǎn)絮凝劑為酸性多聚糖。Paecilomyces sp I-1所產(chǎn)的PF-101是氨基半乳糖以α-1，4糖苷鍵相連而成的分子量大于3×105Da的粘多糖，其分子中80%是N-末端取代的半乳糖胺殘基，8%為N-端乙?；痆10]。

2.5 ETYBF分子量的確定

ETYBF使用凝膠滲透色譜分析，結(jié)果見圖4。

如圖所示，黑曲霉ETYB-13絮凝活性產(chǎn)物的數(shù)均分子量 Mn=2.33×105Da，重均分子量Mw=4.30×105Da，多分?jǐn)?shù)系數(shù)Mw/Mn=1.84，多分?jǐn)?shù)系數(shù)大于1，說明絮凝活性產(chǎn)物是一種混合物。

截至目前，微生物絮凝劑報(bào)道最多的成分是蛋白質(zhì)和多糖。而報(bào)道的多糖分子量都較高，因?yàn)楦鶕?jù)現(xiàn)在較為流行的橋聯(lián)絮凝機(jī)理，在絮凝過程中，高分子量意味著該分子有更多的吸收位點(diǎn)，從而具有更高的架橋能力，最終形成較高的絮凝能力[11]。ETYB-13的絮凝活性產(chǎn)物，根據(jù)凝膠滲透色譜結(jié)果，推測(cè)其分子量在105Da數(shù)量級(jí)，符合上述觀點(diǎn)。同時(shí)凝膠滲透色譜證實(shí)，該絮凝活性產(chǎn)物為混合物。

2.6 ETYBF穩(wěn)定性研究

對(duì)ETYBF的pH與溫度穩(wěn)定性進(jìn)行探討，結(jié)果見圖5。

圖中顯示，ETYBF不受環(huán)境酸堿性變化與溫度變化的影響，改變pH與溫度，絮凝活性產(chǎn)物的絮凝率都不低于80%。

酸堿度的變化會(huì)影響微生物絮凝劑及其被絮凝物表面電荷、帶電狀態(tài)及中和電荷的能力。在一定的pH值范圍內(nèi)，微生物絮凝劑表現(xiàn)出良好的絮凝活性。不同的絮凝劑對(duì)pH值變化所表現(xiàn)的效果也不一樣，同種絮凝劑對(duì)不同的被絮凝物具有不同的pH初始值要求。本研究中，ETYBF保持活性的反應(yīng)環(huán)境pH范圍很廣，對(duì)環(huán)境酸堿度要求不高。

反應(yīng)環(huán)境溫度也會(huì)影響絮凝效率。適當(dāng)提高溫度可提高溶液中粒子運(yùn)動(dòng)的速度，增加粒子間碰撞的幾率，從而提高絮凝率。但當(dāng)溫度過高，性質(zhì)不穩(wěn)定的高分子物質(zhì)空間結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致變性，從而使絮凝活性下降。在本研究中，ETYBF有較好的溫度穩(wěn)定性。

綜上所述，ETYBF成分較穩(wěn)定，因此其儲(chǔ)存與應(yīng)用都較為方便。

3 結(jié)論

使用稀釋平板法、劃線分離法與絮凝活性實(shí)驗(yàn)聯(lián)合，從海水樣品中篩選出一株高絮凝活性真菌。經(jīng)18S rDNA鑒定與形態(tài)學(xué)觀察，確定為黑曲霉。絮凝活性分布實(shí)驗(yàn)證實(shí)其絮凝活性產(chǎn)物僅存在于發(fā)酵上清液中。該菌株在培養(yǎng)72 h達(dá)到生物量最大，并在54 h絮凝活性達(dá)到最高。經(jīng)乙醇沉淀、冷凍真空干燥可獲得該菌株絮凝活性產(chǎn)物ETYBF。對(duì)ETYBF性質(zhì)進(jìn)行研究，定性反應(yīng)、紫外光譜與紅外光譜同時(shí)證實(shí)其活性成分為多糖。凝膠滲透色譜顯示ETYBF是一種混合物，且分子量在105Da數(shù)量級(jí)。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ETYBF的絮凝活性不易受環(huán)境溫度與酸堿性變化的影響。

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New Microbial Flocculant ETYBF for Seawater Treatment

HAO Jian-an,YANG Bo,JIANG Tian-xiang,ZHANG Xiu-zhi,ZHANG Xiao-qing,Zhang Ai-jun,WANG Jing,ZHANG Yu-shan
(The Institute of Seawater Desalination and Multipurpose Utilization,SOA,Tianjin 300192,China)

Aspergillus niger ETYB-13 isolated from Bohai gulf has showed high flocculating activity toward seawater.Microbial flocculant ETYBF was isolated by ethanol precipitation and freeze-vacuum dry from fermentation supernatant of the strain.Flocculating activity curve of the fungi proved that the best time for collecting flocculants was between 48 h and 72 h.Chemical qualitative analysis of ETYBF suggested the main ingredients of ETYBF were acid polysaccharides.Ultraviolet(UV)spectrometry and Fourier-transform infrared(FTIR)spectrometry confirmed this conclusion.Gel permeation chromatography(GPC)showed ETYBF was a mixture.The molecular weight of ETYBF was also indicated above 105Da by GPC.Stability test showed the flocculating activity of ETYBF was not affected by changes of temperature and pH value.

seawater treatment;microbial flocculant ETYBF;polysaccharides

Q939.9

A

1003-2029（2013）01-0064-05

2012-10-25

海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)資助項(xiàng)目（201105026）；國家海洋局青年海洋科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2010139）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（K-JBYWF-2011-T02）

郝建安（1981-），男，工程師，研究方向?yàn)楹Ｋ畠艋c水再利用技術(shù)。Email：phoenix328@hotmail.com

張雨山（1962-），男，研究員，博士，研究方向?yàn)楹Ｋ眉夹g(shù)。Email:yushanzhang@hotmail.com

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