高分子量裂褶多糖發(fā)酵培養(yǎng)工藝的正交優(yōu)化

張雖栓，蔡花真

（河南質(zhì)量工程職業(yè)學(xué)院食品與化工系，河南平頂山 467000）

裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.）是一種珍貴的藥食兩用真菌，裂褶多糖是菌體經(jīng)深層發(fā)酵產(chǎn)生的中性胞外多糖，具有β-（1-6）分支的β-（1-3）-D-葡聚糖的獨(dú)特活性結(jié)構(gòu)[1]。研究表明，裂褶多糖的分子量、結(jié)構(gòu)都存在一定的差異，直接影響到多糖的生物學(xué)活性及應(yīng)用。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的裂褶多糖的分子量多為80 ku～100 ku[2-5]，而分子量大于100 ku 的裂褶多糖具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，尤以分子量在450 ku 左右的裂褶多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用最為廣泛，需求量最大[6]。經(jīng)羧甲基化的裂褶多糖具有良好的溶解性能和抗腫瘤活性，可用于改進(jìn)食品的組織結(jié)構(gòu)，改善食品的質(zhì)地和口感，在調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗輻射等方面有顯著的療效，應(yīng)用在化妝品、抗腫瘤藥物、食品等方面[7]。我們?cè)谠形⑸锇l(fā)酵技術(shù)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化培養(yǎng)基的組合，改進(jìn)裂褶胞外多糖的培養(yǎng)工藝，提高高分子量裂褶多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，為裂褶菌的產(chǎn)業(yè)化栽培和在醫(yī)藥領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供重要的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.）菌種由昆明云覃科技開(kāi)發(fā)有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-F280 全溫度振蕩培養(yǎng)箱：太倉(cāng)市華美生化儀器廠；普通恒溫?fù)u床：中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；2K-82A 型真空干燥箱：上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠；UV-2102PC 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：德國(guó)Bruker 公司；320-S 型pH 計(jì)：METTLER TOLED；AEl00S 型電子分析天平。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)條件

菌種采用PDA 固體培養(yǎng)基，將菌種接種到試管斜面培養(yǎng)基上，于室溫靜置活化3 d，活化好的斜面菌種接入裝有50 mL 種子培養(yǎng)基的三角瓶中27 ℃下培養(yǎng)2 d，得到液體菌種；接著將菌種接種到固體培養(yǎng)基27 ℃下培養(yǎng)7 d～8 d，至菌絲體充滿整個(gè)培養(yǎng)基，結(jié)束發(fā)酵過(guò)程[8-9]。

1.3.2 培養(yǎng)基的選擇

培養(yǎng)基為以12%的葡萄糖為最佳碳源；以0.8%酵母粉和0.2 %NH4NO3為混合氮源；K2HPO4濃度為0.3%、3-吲哚丁酸的濃度為0.04%。

1.3.3 裂褶多糖含量測(cè)定方法

裂褶多糖的含量采用苯酚-硫酸法測(cè)定[10]。

1.3.4 裂褶多糖得率的測(cè)定

裂褶多糖含量的測(cè)定采用水浸-醇沉法提取測(cè)定[11]，經(jīng)適當(dāng)稀釋后用苯酚-硫酸法測(cè)定溶液中多糖含量。裂褶多糖提取率計(jì)算公式如下：

式中：C 為所得溶液中粗糖含量，（mg/mL）；V 為多糖溶液體積，mL；n 為稀釋倍數(shù)；f 為換算因子；m 為原材料質(zhì)量，mg。

1.3.5 相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

高效凝膠滲透色譜儀[12-13]：采用TSK G5000PWXl+G3000PWXl兩柱串聯(lián)。將重均分子量（Mw）分別為5.2×103、1.16×104、2.38×104、4.86×104、1.48×105、2.73×105、4.1×106、6.6×105的標(biāo)準(zhǔn)Waters Dextran 系列進(jìn)樣，記錄保留時(shí)間。1mg/mLSPG 上樣20 μL，流動(dòng)相為0.02 mol/LKH2PO4。流速0.6 mL/min，柱溫40 ℃，記錄其保留時(shí)間。利用隨機(jī)Breeze 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算SPG 均分子量Mn。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳發(fā)酵條件的確定

2.1.1 接種量對(duì)裂褶多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

種子液體的體積與培養(yǎng)基的體積之比為接種量。接種量的大小與菌體的生長(zhǎng)速度和多糖的合成速度有關(guān)，分別取10%～17%的接種量（體積分?jǐn)?shù)）進(jìn)行比較，分析其對(duì)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同接種量對(duì)裂褶多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 The Effect of the inoculum's size on SPG fermentation

圖1 表明，當(dāng)接種量低于13 %時(shí)，多糖含量與接種量呈線性關(guān)系，但是，當(dāng)接種量超過(guò)13 %時(shí)，多糖的產(chǎn)量則有所降低。可能由于接種量過(guò)大，過(guò)度地消耗了碳源而影響了培養(yǎng)的結(jié)果。因此，13%的接種量為宜。

2.1.2 溫度對(duì)裂褶多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

溫度會(huì)直接影響酶的催化活性，也影響了反應(yīng)的速率和產(chǎn)物的合成方向。在一定的溫度范圍內(nèi)，酶的催化活性最好，溫度過(guò)高，酶活性將喪失。所以，溫度的選擇直接影響菌體的生長(zhǎng)和多糖的產(chǎn)量。選擇20 ℃～34 ℃進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)裂褶多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 The Effect of ferment temperature on SPG fermentation

由圖2 可見(jiàn)，溫度過(guò)低與過(guò)高都將嚴(yán)重影響了多糖的合成速率，因此，選擇28 ℃～30 ℃較為適宜。

2.1.3 初始pH 對(duì)裂褶多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

初始pH 的大小不僅會(huì)直接影響菌體的生長(zhǎng)和多糖的合成，還會(huì)影響細(xì)胞膜的通透性和菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的合成，因此，將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH 分別調(diào)為4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5 進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同pH 對(duì)裂褶多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.3 The Effect of the pH on SPG fermentation

由圖3 可知，當(dāng)初始pH 為6～6.5 時(shí)，多糖的產(chǎn)量最高，pH 在偏堿性時(shí)，多糖的產(chǎn)量明顯下降，因此pH選擇6～6.5 較為適宜。

2.1.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)裂褶多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

裂褶多糖的合成與氧化分解都與培養(yǎng)時(shí)間有密切的關(guān)系，分別選取60、80、100、120、140、160 h 來(lái)考察時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)裂褶多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.4 The Effect of the ferment time on SPG fermentation

由圖4 可知，120 h 為最佳發(fā)酵時(shí)間，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的處理在明顯的減少，可能是由于多糖氧化分解的緣故。

2.1.5 表面活性劑對(duì)裂褶多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

當(dāng)裂褶菌培養(yǎng)進(jìn)入產(chǎn)多糖階段，隨多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，發(fā)酵液黏度迅速上升，導(dǎo)致氧氣在發(fā)酵液中的傳質(zhì)系數(shù)明顯下降，影響裂褶多糖的合成，通過(guò)加入不同含量的特定添加劑Tween80，以改變發(fā)酵培養(yǎng)液物理性質(zhì)，增強(qiáng)溶氧性能，考察其對(duì)裂褶多糖合成的影響，結(jié)果如圖5。

圖5 不同含量Tween80 對(duì)裂褶多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.5 The effect of the ferment time on SPG fermentation

以上結(jié)果表明，表面活性劑的加入，降低了氣泡膜的表面張力，縮小了氣泡直徑，從而提高氣泡的比表面積，傳氧系數(shù)與傳氧速率得到提高，從而促進(jìn)多糖產(chǎn)量的提高。采用含有0.2%Tween80 時(shí)，裂褶多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。

2.1.6 發(fā)酵培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)方案進(jìn)一步考察接種量、pH、溫度、發(fā)酵時(shí)間和Tween80 的含量5 個(gè)因素對(duì)高分子量裂褶多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，每個(gè)因素選擇4 個(gè)水平，見(jiàn)表1。

表3 發(fā)酵培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)因素及水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal test in concentration of on SPG fermentation

以裂褶菌干重的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為考核指標(biāo)，設(shè)計(jì)L16（45）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)處理極差分析見(jiàn)表2。

因素與水平對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)有明顯的作用，由表2 可見(jiàn)，一定范圍內(nèi)，5 種因素對(duì)高分子量裂褶多糖培養(yǎng)的影響程度依次E＞B＞D＞A＞C。結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果及5種因素的優(yōu)化組合A1B4C4D4E2，接種量13%（體積分?jǐn)?shù)）；發(fā)酵最適溫度在28 ℃～30 ℃之間；最佳初始pH 為6～6.5，培養(yǎng)周期120 h，0.2%Tween80 表面活性劑。按上述最佳優(yōu)化組合發(fā)酵后，高分子量裂褶多糖的產(chǎn)量可達(dá)1.9%以上。

表2 裂褶多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定L16（45）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of L16（45）orthogomd test in concentration of SPG fermentation

3 裂褶多糖的純化與分子量的測(cè)定

3.1 裂褶多糖的純化

發(fā)酵培養(yǎng)后的菌絲體經(jīng)熱水浸泡提取，乙醇多次沉淀、洗滌，熱水溶解，過(guò)濾，濃縮，干燥獲粗多糖，依次用活性炭褪色，Sevag 法脫蛋白7 次，流水透析，得到裂褶多搪純品。

3.2 裂褶多糖分子量的測(cè)定

采用凝膠過(guò)濾法測(cè)定分子量，繪制標(biāo)準(zhǔn)多糖洗脫曲線，再結(jié)合裂褶多糖的洗脫曲線做對(duì)比查表可知所得裂褶多糖的分子量約為445 ku。（詳見(jiàn)高分子量裂褶多糖的分離與純化）。

4 結(jié)論

1）發(fā)酵培養(yǎng)條件的選擇是：接種量為13%（體積分?jǐn)?shù)）；發(fā)酵最適溫度在28 ℃～30 ℃之間；最佳初始pH為6～6.5，培養(yǎng)周期為120 h。在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下加入0.2%Tween80 表面活性劑可以改善發(fā)酵液的溶氧水平，有助于提高SPG 的產(chǎn)量，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)1.9%。

2）用高效凝膠色譜分析確定樣品單糖組分為葡萄糖，相對(duì)分子質(zhì)量為445 ku，研究發(fā)現(xiàn)，裂褶多糖的抗腫瘤活性與分子量大小有關(guān)，分子量較大時(shí)才具有抗腫瘤活性，這為后期裂褶多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)提供了理論參考。

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