超聲波輔助提取甜葫蘆中葫蘆素E的工藝研究

范宏，朱珠，文連奎，許麗麗，王敬涵

（1.吉林工商學(xué)院糧油食品深加工吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130062；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

甜葫蘆[Lagenaria siceraria（Molina）Standl.var.hispisa（Thund.）Hara]，又名菜葫蘆，干瓢，是屬于葫蘆科葫蘆屬的一種爬藤植物，同時(shí)是一種優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的蔬菜，不僅含有維生素、葡萄糖和果糖，同時(shí)還含有鈣、磷、鉀等多種元素和氨基酸，除其嫩果可食用外，嫩苗、嫩葉亦常作蔬菜食用[1-3]。甜葫蘆含有的葫蘆素是一類高度氧化的四環(huán)三萜類植物次生物質(zhì)，是葫蘆科30 多屬100 多種植物的特征化合物[4]。近代研究表明葫蘆素在生態(tài)系統(tǒng)中作為異源化學(xué)信息素可起到保護(hù)葫蘆科植物免受眾多植食性動(dòng)物和病原菌的侵害的作用[5-7]。葫蘆素同時(shí)還具有消退黃疸，消除腹水、抗腫瘤等多種生物活性，在對(duì)激發(fā)細(xì)胞免疫功能，抑制肝纖維增生等方面也有一定的作用[8-11]。超聲波提取技術(shù)是近年來興起的提取技術(shù)，與傳統(tǒng)提取方法相比，具有生產(chǎn)周期短、有效成分不易被破壞、節(jié)約提取成本等優(yōu)點(diǎn)[12]。本實(shí)驗(yàn)利用超聲波輔助浸提工藝，確定超聲波輔助提取甜葫蘆中的葫蘆素E 的最佳提取工藝條件，從而為甜葫蘆的開發(fā)和利用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

甜葫蘆干制品：市售；甲醇（色譜純）；葫蘆素E 標(biāo)準(zhǔn)品（編號(hào)130502）：北京捷誠(chéng)科遠(yuǎn)化工技術(shù)研究所。

1.1.2 主要儀器

Y92-11 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：TECHCOMP；TGL-16G 型臺(tái)式離心機(jī)：上海安亨科學(xué)儀器廠；A-88 組織搗碎機(jī)：江蘇金壇醫(yī)療儀器廠。

1.2 步驟與方法

1.2.1 葫蘆素E 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.1.1 葫蘆素E 最大吸收峰的測(cè)定

取葫蘆素E 的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（190 nm～1 100 nm），得到葫蘆素E 標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收峰為234 nm，所以將葫蘆素E 的檢測(cè)波長(zhǎng)確定為234 nm。

1.2.1.2 葫蘆素E 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的葫蘆素E 標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL 的容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為50 μg/mL 的葫蘆素E 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，量取該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，用甲醇定容到10 mL 容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后在波長(zhǎng)234 nm 處測(cè)吸光值，以葫蘆素E 的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程。紫外分光光度法測(cè)定葫蘆素E 的含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葫蘆素E 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Cucurbitacin E standard curve

1.2.2 樣品中葫蘆素E 含量的測(cè)定

將甜葫蘆干制品進(jìn)行粉碎、過篩（80 目），精確稱量甜葫蘆干粉2 g，放入50 mL 的燒杯中，加入一定體積的甲醇溶液，常溫條件下按一定的超聲條件（料液比，溶劑濃度，提取時(shí)間，超聲波功率）提取葫蘆素E，離心10 min，去掉沉淀純化并取上清液，將上清液稀釋100 倍經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)得每個(gè)上清液的吸光值，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中葫蘆素E 的含量。葫蘆素E得率的計(jì)算公式為：

式中：a 為葫蘆素E 得率，%；m1為樣品溶液中葫蘆素E 質(zhì)量，g；m2為甜葫蘆干粉的質(zhì)量，g。

1.2.3 超聲波提取葫蘆素E 的單因素及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別針對(duì)不同的料液比（1 ∶8、1 ∶9、1 ∶10、1 ∶11、1 ∶12 g/mL）、溶劑濃度（50%、60%、70%、80%、90%）、提取時(shí)間（10、15、20、25、30 min）、超聲波功率（200、300、400、500、600 W）影響葫蘆素E 得率的因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用L（934）正交試驗(yàn)，以吸光值為考察指標(biāo)，確定超聲波輔助提取甜葫蘆中葫蘆素E 的最佳提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波提取葫蘆素E 的單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 料液比對(duì)葫蘆素E 得率的影響

在溶劑甲醇濃度為70%，時(shí)間為20 min，超聲功率為400 W 條件下對(duì)葫蘆素E 的進(jìn)行超聲波提取，確定適宜的料液比。料液比對(duì)葫蘆素E 得率的影響見圖2。

由圖2 可知，當(dāng)料液比大于1 ∶10（g/mL）時(shí)，得率將不再增加。料液比的大小影響著固相主體與液相主體之間的濃度差，即傳質(zhì)推動(dòng)力，料液少，繼而兩相間的濃度差小，從而傳質(zhì)推動(dòng)力小。其次，料液比的大小還會(huì)影響兩相的混合度情況。料液的提高必然會(huì)較大程度的提高傳質(zhì)推動(dòng)力，但同時(shí)也提高了生產(chǎn)成本及后續(xù)處理的難度，所以溶劑也不宜太多。因此，本試驗(yàn)料液比選擇1 ∶9、1 ∶10、1 ∶11（g/mL）3 個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 料液比對(duì)葫蘆素E 得率的影響Fig.2 Effect of different rate of solid to solution on yield of cucurbitacin E

2.1.2 溶劑濃度對(duì)葫蘆素E 得率的影響

在料液比（g/mL）為1 ∶10，時(shí)間為20 min，超聲功率為400 W 條件下對(duì)葫蘆素E 的進(jìn)行超聲波提取，確定適宜的溶劑濃度。溶劑濃度對(duì)葫蘆素E 得率的影響分別見圖3。

圖3 溶劑濃度對(duì)葫蘆素E 得率的影響Fig.3 Effect of different solvent concentration on yield of cucurbitacin E

由圖3 可知，當(dāng)溶劑甲醇濃度小于70%時(shí)，得率隨之甲醇濃度的增加而增加，甲醇濃度為70%時(shí)，得率最大，提取效果最好；但隨著甲醇濃度繼續(xù)增加，得率下降，原因是一些雜質(zhì)同時(shí)也溶解出來。因此，本試驗(yàn)甲醇濃度選擇60%、70%、80%3 個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)葫蘆素E 得率的影響

在料液比（g/mL）為1 ∶10，溶劑甲醇濃度為70%，超聲功率為400 W 條件下對(duì)葫蘆素E 的進(jìn)行超聲波提取，確定適宜的提取時(shí)間。提取時(shí)間對(duì)葫蘆素E 得率的影響分別見圖4。

由圖4 可知，隨著提取時(shí)間的增加，葫蘆素E 得率先升高后降低，當(dāng)提取時(shí)間為20 min 時(shí)，葫蘆素E得率最高。因此，本試驗(yàn)提取時(shí)間選擇15、20、25 min 3 個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.4 超聲波功率對(duì)葫蘆素E 得率的影響

圖4 超聲時(shí)間對(duì)葫蘆素E 得率的影響Fig.4 Effect of different ultrasonic time on yield of cucurbitacin E

在料液比（g/mL）為1 ∶10，溶劑甲醇濃度為70%，時(shí)間為20 min 條件下對(duì)葫蘆素E 的進(jìn)行超聲波提取，確定適宜的超聲波功率。超聲波功率對(duì)葫蘆素E 得率的影響分別見圖5。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)葫蘆素E 得率的影響Fig.5 Effect of different ultrasonic power on yield of cucurbitacin E

由圖5 可知體系中介質(zhì)分子的振動(dòng)速度會(huì)隨著超聲功率的增加而增大，在超聲強(qiáng)度高于空化閾值后，空化氣泡也就隨著介質(zhì)分子振動(dòng)速度的增大而增多，空化效果也就更明顯[13]，本實(shí)驗(yàn)超聲功率為400 W時(shí)，葫蘆素E 得率最高。因此，本試驗(yàn)超聲波功率選擇300、400、500 W 3 個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 超聲波提取葫蘆素E 的正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響葫蘆素E 得率的因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)（見表1），葫蘆素E 正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 葫蘆素E 提取的L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels design of L9（34）orthogonal tests for cucurbitacin E extraction

由極差R 大小分析可知，影響葫蘆素E 提取效果因素的主要因素順序?yàn)锽＞C＞A＞D，即溶劑濃度＞時(shí)間＞料液比＞超聲波功率，由K 值可知，其最優(yōu)組合為A2B2C1D3，即料液比1 ∶10（g/mL）、溶劑濃度70%、超聲時(shí)間15 min、超聲功率500 W。然而通過正交試驗(yàn)得出的最佳條件組合并不在正交試驗(yàn)表的9 個(gè)試驗(yàn)內(nèi)。因此為了得到確定的結(jié)果，按照上面得出的最佳條件A2B2C1D3進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

表2 葫蘆素E 提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal tests for cucurbitacin E extraction

2.3 最佳工藝條件驗(yàn)證試驗(yàn)

按A2B2C1D3，即料液比1∶10（g/mL）、溶劑濃度70%、超聲時(shí)間15 min、超聲功率500 W 的條件下分別進(jìn)行3 次葫蘆素E 超聲波提取的平行實(shí)驗(yàn)，平均得率為0.695%，由此可知正交試驗(yàn)的結(jié)果是準(zhǔn)確的，確定A2B2C1D3為葫蘆素E 超聲波提取的最佳工藝選擇。

2.4 不同因素對(duì)葫蘆素E 得率的影響分析

由2.2 可知，溶劑濃度對(duì)葫蘆素E 的提取效果影響最大，超聲波功率影響最小，時(shí)間和料液比依次次之。原因是依據(jù)相似相溶原理，葫蘆素E 易溶于有機(jī)溶劑，所以溶劑濃度對(duì)葫蘆素E 的提取效果影響較大。超聲波破碎過程是一個(gè)物理過程，而根據(jù)甜葫蘆的屬性和葫蘆素E 的結(jié)構(gòu)特性，葫蘆素E 的提取效果受超聲波功率影響最小。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)得到了最佳的提取條件為：料液比1 ∶10（g/mL）、溶劑濃度70%、超聲時(shí)間15 min、超聲功率500 W。在此條件下葫蘆素E 的得率為0.695%

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