瑞舒伐他汀對兔心肌梗死后心室重構(gòu)及功能影響的機(jī)制研究

錢煒春 張豐富 賈海波 丁競競 陳顏夙

心肌細(xì)胞壞死是急性心肌梗死后心肌死亡的主要方式，但不是唯一方式。近年來的實驗和臨床研究證實，心肌細(xì)胞凋亡也是心肌細(xì)胞的一種死亡形式，且其導(dǎo)致的心肌細(xì)胞丟失在急性心肌梗死后的心室重塑及隨后的心力衰竭中起重要作用［1］。急性心肌梗死后存在著數(shù)量不等的凋亡細(xì)胞，尤其是梗死邊緣區(qū)，這對決定梗死范圍的大小起了一定的作用［2］。而心肌梗死邊緣區(qū)的細(xì)胞凋亡也代表著一種不可逆的細(xì)胞死亡形式，它的數(shù)量和分布范圍直接影響著這種嚴(yán)重心血管事件的預(yù)后。在嚴(yán)重的心肌血流灌注障礙(如急性心肌梗死、持續(xù)冠狀動脈痙攣等)引起心肌急性缺血、損傷、細(xì)胞壞死及泵功能障礙的同時，伴隨著心肌細(xì)胞凋亡，Caspase－3、p38、p－p38 等蛋白表達(dá)的異常;通過檢測心肌細(xì)胞凋亡率(apoptosis index，AI)及上述蛋白不同表達(dá)水平可了解心肌梗死后導(dǎo)致心功能惡化可能的機(jī)制，還可客觀評價各種干預(yù)措施(如經(jīng)皮冠狀動脈介入治療等再灌注治療)和藥物保護(hù)的效果。瑞舒伐他汀作為最新一代的調(diào)脂藥物，是目前公認(rèn)的強(qiáng)力調(diào)脂藥物，近期國外初步研究提示它可能具有顯著的獨立于調(diào)脂作用以外的心臟保護(hù)作用，如抗炎、抗氧化、改善血管內(nèi)皮功能、穩(wěn)定斑塊等，但目前瑞舒伐他汀是否可以防治心力衰竭的爭議還很大，本研究將通過動物實驗對此進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與分組 45 只雄性新西蘭大白兔均來自江蘇省南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場［證號:SCXK(蘇)2007－0008］，18 月齡，平均體質(zhì)量(2.40 ±0.12)kg。隨機(jī)分成3 組:假手術(shù)組(S 組，n=15)，心肌梗死對照組(MI 組，n =15)，心肌梗死瑞舒伐他汀干預(yù)組(R 組，n=15)。

1.2 模型的建立與藥物干預(yù) MI 組和R 組兔結(jié)扎左冠狀動脈前降支建立急性心肌梗死模型。S 組開胸后于兔的左室前降支下心肌縫線，但不結(jié)扎，其余同MI組。心肌梗死模型建立成功后，R 組大白兔按照瑞舒伐他汀10 mg/(kg·d)灌胃2 周，MI 組及S 組按照相同容量的生理鹽水灌胃2 周。

1.3 心電圖判定心肌梗死模型建立成功 術(shù)后24 h使用普通心電圖儀記錄各組兔胸前導(dǎo)聯(lián)心電圖，相關(guān)導(dǎo)聯(lián)均存在胸前導(dǎo)聯(lián)ST 段抬高或出現(xiàn)病理性Q 波則證明模型建立成功。

1.4 心臟超聲檢測兔心功能 各組兔行干預(yù)后2 周，在清醒狀態(tài)下接受超聲心動圖(7.5 MHz 探頭)檢查，在二維切面上顯示胸骨旁左心短軸乳頭肌水平觀察，然后采用M 型超聲心動圖方法分別測量左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)和舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)，并推算出左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.5 檢測細(xì)胞凋亡率 常規(guī)TUNEL 法(TUNEL 試劑盒購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)檢測心肌組織中的凋亡心肌細(xì)胞。光鏡觀察(OLYMPUS CK40 倒置光學(xué)顯微鏡)細(xì)胞核棕色為陽性。每組每例動物標(biāo)本計數(shù)5 個視野，AI =視野凋亡細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 檢測心肌梗死邊緣區(qū)Caspase－3 的表達(dá) 用機(jī)械法剪碎心肌組織，過濾并制成單細(xì)胞懸液。在試管中加入5 ml 單細(xì)胞懸液，1500 r/min，離心5 min，去上清，加入100 μl 固定液后混勻，室溫靜置15 min。加4 ml PBS 緩沖液，1500 r/min，離心5 min，去上清，加入100 μl 裂解液(Beckman Coulter，美國)，室溫靜置5 min。加5 μl Caspase－3 抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國)，混勻，避光靜置15 min。加4 ml PBS 緩沖液，離心，去上清，加0.5 ～1 ml PBS 緩沖液。使用流式細(xì)胞儀(BD FACSCanto TM Ⅱ，日本)檢測。

1.7 檢測p38 和p－p38 蛋白 常規(guī)方法提取樣本蛋白，標(biāo)化后聚丙烯酰胺凝膠電泳(70V，30 min;100 V，150 min);轉(zhuǎn)膜后，以5%的脫脂牛奶1 ∶200 稀釋兔單抗p38 抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國)，兔單抗p－p38 抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國);1 ∶1000稀釋兔多抗actin 抗體(博士德公司，武漢);置搖床4 ℃孵育過夜;分別用5% 的脫脂牛奶1 ∶200 稀釋HPR 標(biāo)記的鼠、兔二抗(KPL，美國)常溫?fù)u床上孵育PVDF 膜;然后于凝膠成像系統(tǒng)(Alpha FC2，美國)曝光。

1.8 數(shù)據(jù)處理 實驗所得Western blot 條帶，由Photoshop 軟件處理后，采用BandScan 軟件對免疫印跡條帶掃描后進(jìn)行半定量分析。用GraphPad Prism 4 軟件作圖。用SPSS 11.0 做統(tǒng)計分析，3 組間比較用ANOVA，采用SNK 法進(jìn)行兩兩比較，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

干預(yù)2 周后，3 組新西蘭大白兔均顯示為消瘦型，平均體質(zhì)量(2.25 ±0.13)kg。心肌梗死后24 h 存活新西蘭大白兔38 只，在隨后2 周的干預(yù)期內(nèi)共死亡5只，最終存活兔:S 組為12 只，MI 組10 只，R 組11 只。

2.1 心電圖改變 S 組、MI 組和R 組術(shù)后24 h 心電圖如圖1 所示。與S 組相比，MI 組與R 組胸前導(dǎo)聯(lián)ST 段明顯抬高。

圖1 各組術(shù)后24 h 心電圖

2.2 瑞舒伐他汀干預(yù)2 周后對大白兔心臟功能的影響 與S 組比較，R 組和MI 組LVEDD 和LVESD 均顯著增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);而R 組的LVEDD 和LVESD 均低于MI 組(P ＜0.05)。與S 組比較，R 組與MI 組LVEF 降低(P ＜0.05);而R 組的LVEF 高于MI 組(P ＜0.05)。見表1。

表1 瑞舒伐他汀干預(yù)對大白兔心肌梗死后心臟功能的影響(xˉ±s，n=15)

2.3 瑞舒伐他汀干預(yù)對大白兔心肌梗死邊緣區(qū)細(xì)胞凋亡的影響 MI 組［(24.43 ±3.24)%］和R 組［(9.30 ±0.32)%］AI 明顯高于S 組［(2.67 ± 0.33)%］(P ＜0.05)，R 組AI 明顯低于MI 組(P ＜0.05)，見圖2。

圖2 各組心肌細(xì)胞凋亡光鏡觀察(×200)

2.4 瑞舒伐他汀干預(yù)對大白兔心肌梗死邊緣區(qū)Caspase－3 表達(dá)的影響 流式細(xì)胞儀檢測各組新西蘭大白兔心肌細(xì)胞Caspase－3 的表達(dá)，R 組及MI 組心肌梗死邊緣區(qū)Caspase－3 的表達(dá)均高于S 組(P ＜0.01);而R 組低于MI 組(P ＜0.01)。見圖3。

2.5 瑞舒伐他汀干預(yù)對大白兔心肌梗死邊緣區(qū)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖4 所示，MI 組、R 組與S 組p38 表達(dá)均未見統(tǒng)計學(xué)差異(P ＞0.05)。MI 組和R組p－p38 表達(dá)均高于S 組(P ＜0.05)，而R 組低于MI組(P ＜0.05)。

3 討論

圖3 各組心肌細(xì)胞Caspase－3 表達(dá)

圖4 各組兔心肌梗死邊緣區(qū)p38、p－p38 的表達(dá)

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)，是一種主動性基因控制的細(xì)胞死亡方式，以細(xì)胞收縮、細(xì)胞膜完整并發(fā)泡、染色質(zhì)固縮、凋亡小體形成而細(xì)胞器完整等為主要特征［2］。以往認(rèn)為，心肌細(xì)胞壞死是急性心肌梗死后心肌死亡的唯一方式，心室重構(gòu)是心肌細(xì)胞壞死所致。心肌梗死后梗死區(qū)的心肌細(xì)胞凋亡是引起左心室收縮功能降低和早期重塑的另一種方式［3］;研究發(fā)現(xiàn)除梗死區(qū)外，非梗死區(qū)亦可檢出進(jìn)行性的細(xì)胞死亡，主要是細(xì)胞凋亡，梗死邊緣區(qū)和非梗死區(qū)的心肌細(xì)胞凋亡則是引起晚期心功能不全和左心室重塑的重要因素［4］。Palojoki 等［5］發(fā)現(xiàn)實驗鼠遠(yuǎn)離梗死區(qū)在心肌梗死后3 h 凋亡增加，且在4 周保持較高水平，遠(yuǎn)離梗死區(qū)細(xì)胞凋亡與心室內(nèi)徑擴(kuò)大相關(guān)。Qin等［6］在實驗中發(fā)現(xiàn)，兔心肌梗死后出現(xiàn)進(jìn)行性心室擴(kuò)大的同時，伴隨有非梗死區(qū)大量心肌細(xì)胞凋亡。Schwarz等［7］證實，從大鼠心肌梗死后1 d 開始，在非梗死區(qū)細(xì)胞凋亡被激活，持續(xù)4 周并與進(jìn)行性心力衰竭密切相關(guān)。本研究使用TUNEL 法，發(fā)現(xiàn)新西蘭大白兔急性心肌梗死后2 周左心室非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡率明顯高于假手術(shù)組，并通過超聲心動圖研究發(fā)現(xiàn)伴有心臟功能的惡化;同時本研究發(fā)現(xiàn)通過瑞舒伐他汀干預(yù)后可改善心肌梗死后的心室重構(gòu)，防止LVEF 的降低。瑞舒伐他汀干預(yù)后心肌細(xì)胞凋亡率則低于心肌梗死對照組，表明瑞舒伐他汀治療能夠有效減少心肌梗死后兔心肌細(xì)胞凋亡。通過以上研究可推斷瑞舒伐他汀可通過抑制心肌凋亡而改善心功能。

目前認(rèn)為他汀類藥物抑制心肌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制為:(1)通過抗氧化作用抑制心肌凋亡［8－10］。(2)通過調(diào)控磷脂酰肌醇－3 激酶和絲氨酸－蘇氨酸激酶［11］，下調(diào)Caspase－3 活性［12］。Caspase－3 為天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族成員，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。Caspase－3 在細(xì)胞的凋亡過程中起關(guān)鍵作用，其被認(rèn)為是凋亡途徑中處于中心地位的執(zhí)行者［13］。而絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是一組調(diào)控細(xì)胞生長、凋亡等生命活動的絲/蘇氨酸蛋白激酶。MAPKs 信號級聯(lián)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、生存和死亡等一系列生物學(xué)功能［14］。在哺乳動物，MAPKs家族主要包括3 個主要成員，即ERK、JNK 和p38。葉鑫生等［15］認(rèn)為MAPKs 家屬中p38 主要具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。Matsumoto－Ida 等［16］發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌梗死后非梗死區(qū)心肌中p38 在蛋白水平并沒有增高，但pp38 在心肌梗死后7 d 時升高了2.35 ±0.06 倍。作為凋亡程序中最后的執(zhí)行者，Caspase－3 發(fā)揮重要的樞紐作用［13］，p－p38 能夠激活Caspase－3 的活性，啟動了凋亡通路［17－19］，活化的Caspase－3 又進(jìn)一步切割不同的底物，導(dǎo)致蛋白酶級聯(lián)切割放大，最終使細(xì)胞走向凋亡［20］。本研究發(fā)現(xiàn)p－p38 的表達(dá)在R 組低于MI 組，同時Caspase－3 的表達(dá)在R 組也低于MI 組，推測瑞舒伐他汀可能通過抑制p38 的磷酸化，從而降低Caspase－3 的活化，最終減少心肌細(xì)胞凋亡。

目前使用他汀類藥物用于心力衰竭的治療還一直存在爭議［21］，一方面他汀類藥物具有很多調(diào)脂以外的有益作用，如抗炎作用和改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能等等，因此理論上應(yīng)該可以改善心力衰竭患者的預(yù)后。然而，他汀類藥物也可能存在對心力衰竭患者不利的一面，如他汀會引起血漿中輔酶Q10 的降低，而輔酶Q10是抗氧化劑，在線粒體的氧化磷酸化中起輔酶的作用，因此他汀對線粒體的這種影響可能對心室的功能和運動耐量不利;另外心力衰竭時，內(nèi)毒素增加，刺激炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生增多，而血漿中脂蛋白可能具有凝固或中和內(nèi)毒素的作用，因此人們推測他汀的降脂作用可能增加內(nèi)毒素的作用，從而導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子水平升高，對慢性心力衰竭的預(yù)后產(chǎn)生不利的影響。早期雖然沒有大規(guī)模的臨床試驗來評價他汀類藥物對心力衰竭的療效，但一些回顧性分析結(jié)果［22－25］顯示，他汀類藥物對心力衰竭是有益的。

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