任秀芳,周鑫,趙朝陽,水燕,徐增洪,沈懷舜,張萍,柏愛旭

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海201306;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心,江蘇無錫214081)

殼聚糖對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)、血清相關(guān)免疫因子、肌肉成分和消化酶的影響

任秀芳1、2,周鑫2,趙朝陽2,水燕2,徐增洪2,沈懷舜2,張萍1、2,柏愛旭1、2

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海201306;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心,江蘇無錫214081)

以體質(zhì)量為 (21.55±1.62)g的克氏原螯蝦Procambarus clarkii為研究對(duì)象,投喂殼聚糖添加量分別為0(對(duì)照)、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%的飼料,研究殼聚糖對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)、血清相關(guān)免疫因子、肌肉成分和消化酶活性的影響。試驗(yàn)共進(jìn)行60 d。結(jié)果表明:1.0%殼聚糖添加組試驗(yàn)蝦的特定生長(zhǎng)率顯著高于其他各組 (P＜0.05),1.5%殼聚糖添加組試驗(yàn)蝦的死亡率和蛻殼死亡率均最高,且顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05);1.0%和2.0%殼聚糖添加組試驗(yàn)蝦血清中的酚氧化酶 (PO)活性顯著高于對(duì)照組(P＜0.05),各添加組血清中堿性磷酸酶 (ALP)活性均顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05);除1.0%、2.0%殼聚糖添加組外,其他添加組血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)活性均低于對(duì)照組;各添加組血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性均顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05);除2.0%殼聚糖添加組外,其他添加組試驗(yàn)蝦肌肉粗蛋白質(zhì)含量較對(duì)照組均低;除2.0%殼聚糖添加組外,其他添加組粗脂肪含量較對(duì)照組均高,其中1.0%、1.5%和3.0%添加組顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05);僅1.0%添加組肌肉灰分顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05);僅2.0%添加組肌肉水分含量顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05);1.0%添加組試驗(yàn)蝦肝胰腺中胰蛋白酶和脂肪酶活性以及腸道中的脂肪酶活性顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05);1.5%添加組試驗(yàn)蝦肝胰腺和腸道中的淀粉酶活性均顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05)。研究表明,在本試驗(yàn)條件下,建議成蝦飼料中殼聚糖的添加量為0.5% ～1.5%,殼聚糖對(duì)克氏原螯蝦起到一定的免疫保護(hù)作用,并能增強(qiáng)其消化生理機(jī)能。

克氏原螯蝦;殼聚糖;酚氧化酶;消化酶;肌肉成分

殼聚糖是由甲殼素脫鈣、去除脂肪和蛋白后脫乙酰基得到的一種帶正電荷的高分子堿性多糖。通常將脫乙酰度為55%以上的甲殼素稱作殼聚糖,由于殼聚糖成纖成膜性能好,能與動(dòng)物的器官、組織和細(xì)胞有良好的生物相容性,沒有免疫原性,并具有生物可降解性和可被吸收利用性等特點(diǎn),在醫(yī)藥、環(huán)保、農(nóng)業(yè)、飼料、水產(chǎn)等領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中,殼聚糖作為促生長(zhǎng)劑添加到羅非魚Oreochromis niloticus飼料中,通過提高羅非魚腸道和肝胰腺的蛋白酶、淀粉酶和肝臟極低密度脂蛋白的活性,增強(qiáng)機(jī)體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和脂肪轉(zhuǎn)化[1],從而達(dá)到促生長(zhǎng)的作用。同時(shí),殼聚糖作為免疫增強(qiáng)劑,可保護(hù)鮭科魚類免遭細(xì)菌性疾病的侵染[2-3];增強(qiáng)烏頰魚SparusaurataL.的呼吸暴發(fā)和吞噬細(xì)胞活性[4-5];可在短期內(nèi)提高感染了溶藻弧菌的凡納濱對(duì)蝦Litopenaeus vannamei的存活率、血細(xì)胞數(shù)、呼吸暴發(fā)和吞噬細(xì)胞活性[6]。目前,殼聚糖用在經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物中的研究報(bào)道較少。本研究中,通過在克氏原螯蝦Procambarus clarkii基礎(chǔ)飼料中添加一定量的殼聚糖,并檢測(cè)克氏原螯蝦攝食60 d后相關(guān)免疫因子的活性、消化酶活性和肌肉營養(yǎng)成分的變化,以探討殼聚糖對(duì)促進(jìn)克氏原螯蝦生長(zhǎng)及增強(qiáng)非特異性免疫功能的影響,旨在為殼聚糖在蝦蟹養(yǎng)殖與飼料生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用克氏原螯蝦取自江蘇盱眙恒旭科技有限公司,樣品蝦用基礎(chǔ)飼料馴化,暫養(yǎng)10 d后用于試驗(yàn)。

阿拉丁?殼聚糖購自上海晶純實(shí)業(yè)有限公司,為白色粉末,其相對(duì)分子質(zhì)量為1 000 000,脫乙酰度≥95%,水分＜8%,灰分＜1%。

試驗(yàn)用飼料配方及營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)配方的原料配比及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Tab.1 Ingredient and nutrition level of basal diet(dry matter) w/%

將試驗(yàn)原料粉碎,過60目篩,混合均勻,制成基礎(chǔ)飼料。在基礎(chǔ)飼料中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%的殼聚糖,制成6種試驗(yàn)飼料,飼料配方組分用糊精調(diào)平。飼料顆粒直徑為2 mm,自然曬干,置于-15℃下冷凍保存。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)分為6組,每組設(shè)3個(gè)平行。取體色正常、大小均勻、附肢完好、健康活潑、體質(zhì)量為 (21.55±1.62)g的克氏原螯蝦,隨機(jī)分配到18個(gè)水族箱 (100 cm×50 cm×50 cm)中,每箱放蝦15只。水族箱水深15～20 cm,放入樹枝和易拉罐作為隱蔽物。試驗(yàn)開始前和結(jié)束后均饑餓1 d,每日8:00和19:00投喂,投喂量為蝦體質(zhì)量的2% ～3%,根據(jù)攝食情況加以調(diào)整。試驗(yàn)期間,保持溶解氧≥6.0 mg/L,pH為7.5～8.0,水溫為 (22±1)℃。飼養(yǎng)期為60 d,用增氧泵連續(xù)充氣,每天換充分曝氣的自來水1/3～1/2,用皮管虹吸出殘餌和排泄物。

1.2.2 樣品的采集與制備

1)生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定與計(jì)算。試驗(yàn)結(jié)束后用電子天平稱量克氏原螯蝦的體質(zhì)量,試驗(yàn)過程中記錄各組蝦的死亡數(shù)和蛻殼死亡數(shù)。生長(zhǎng)指標(biāo)的計(jì)算公式如下:

特定生長(zhǎng)率(%/d)=100×[ln(末均體質(zhì)量)-ln(初均體質(zhì)量)]/飼養(yǎng)天數(shù),

死亡率(%)=100×(死亡蝦總數(shù)/蝦總數(shù)),

蛻殼死亡率(%)=100×(蛻殼死亡數(shù)/蝦總數(shù))。

2)血清的制備。試驗(yàn)結(jié)束后,從各組隨機(jī)選取克氏原螯蝦5尾,用濾紙吸干蝦體水分,用1 mL的一次性注射器從蝦的頭胸甲后部刺入心臟,抽取血液,放入離心管內(nèi),置于冰箱 (4℃)中過夜,用冷凍離心機(jī)以5 000 r/min離心10 min,取上清液放入冰箱 (-20℃)中備用,24 h內(nèi)測(cè)定。用邁瑞全自動(dòng)生化分析儀BS-400測(cè)定血清中堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性。

3)粗酶液的制備。試驗(yàn)結(jié)束后,從各試驗(yàn)組隨機(jī)選取克氏原螯蝦6尾,用濾紙吸干蝦體水分,取其肝胰腺和全腸,用去離子水清洗腸道內(nèi)容物。每?jī)晌参r的部分肝胰腺或全腸作為一個(gè)樣本。將每個(gè)樣本稱重,置于玻璃勻漿器中,用移液器移取9倍于組織塊的預(yù)冷勻漿介質(zhì) (pH 7.4,0.01 mol/L Tris-HCl,0.000 1 mol/L EDTA-2Na,0.01 mol/L蔗糖,0.8%的氯化鈉溶液),充分勻漿后,用低溫低速離心機(jī)以2 000 r/min離心10 min,取上清液即為粗酶液,于4℃下保存,24 h內(nèi)測(cè)定。

4)肌肉樣品的采集。將采集完血液和肝腸后的克氏原螯蝦去除頭胸甲和背甲,取蝦肉剪碎,混合均勻,置于冰箱 (-20℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酚氧化酶的測(cè)定 綜合王建國等[7]和Huang等[8]的方法,以0.1 mol/L的磷酸鉀鹽緩沖液 (將61.9mL 0.1mol/L KH2PO4溶液和38.1mL 0.1 mol/L K2HPO4溶液混合,稀釋至1 L,調(diào)pH為6.6)為溶劑,配制濃度為3 mg/mL的L-DOPA (Sigma公司產(chǎn)品)溶液。室溫下將40μL血清和1 960μL L-DOPA溶液混勻,置于1 cm光徑的比色杯中,準(zhǔn)確計(jì)時(shí)6 min時(shí),于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值OD,同時(shí)取2 mL L-DOPA溶液作為空白測(cè)定其吸光值OD0。酚氧化酶活性定義為:每毫升樣品每分鐘吸光度值增加0.001為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.4 消化酶的測(cè)定 胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性均采用試劑盒 (南京建成生物工程研究所產(chǎn)品)測(cè)定[9]。于37℃水浴鍋中水浴,用紫外分光光度計(jì)讀取OD值。

于253 nm波長(zhǎng)下讀取胰蛋白酶反應(yīng)體系中的OD值。胰蛋白酶活性定義為:在37℃條件下,每毫克蛋白中含有的胰蛋白酶每分鐘使吸光度變化0.003即為一個(gè)酶活力單位 (U)。

于660 nm波長(zhǎng)下讀取淀粉酶反應(yīng)體系中的OD值。淀粉酶活性定義為:7℃條件下,每毫克組織蛋白與底物作用30 min,水解10 mg淀粉為一個(gè)淀粉酶活力單位 (U)。

于420 nm波長(zhǎng)下讀取脂肪酶反應(yīng)體系中的OD值。脂肪酶活性定義為:37℃條件下,每毫克組織蛋白與底物作用1 min,每消耗1μmol底物為一個(gè)酶活力單位 (U)。

1.2.5 肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分的測(cè)定 采用常壓干燥法測(cè)定水分含量,采用凱氏定氮法測(cè)定肌肉粗蛋白質(zhì)含量,采用索氏抽提法測(cè)定粗脂肪含量,采用干灰化法測(cè)定灰分含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,用 SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析 (Oneway ANOVA),用Duncan法進(jìn)行多重比較,顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 克氏原螯蝦攝食不同含量殼聚糖飼料時(shí)的特定生長(zhǎng)率和死亡率

從表2可見:試驗(yàn)結(jié)束時(shí),各組克氏原螯蝦平均體質(zhì)量均無顯著性差異 (P＞0.05);各組試驗(yàn)蝦的特定生長(zhǎng)率、死亡率、蛻殼死亡率隨著殼聚糖添加量的增加均呈先升高后降低的趨勢(shì),其中添加水平為1.0%的組試驗(yàn)蝦特定生長(zhǎng)率最高,顯著高于除0.5%添加組外的其余各組 (P＜0.05);添加水平為0.5%的組試驗(yàn)蝦死亡率最低,顯著低于其余各組 (P＜0.05);添加水平為1.5%的組試驗(yàn)蝦蛻殼后死亡率最高,顯著高于其余各組 (P＜0.05)。

表2 殼聚糖對(duì)克氏原螯蝦特定生長(zhǎng)率和死亡率的影響Tab.2 Effects of dietary chitosan supplemention on specific grow th rate and mortality rate in red swamp crayfish Procambarus clarkii

2.2 克氏原螯蝦攝食不同含量殼聚糖飼料時(shí)血清中的相關(guān)免疫因子

從表3可見:飼料中殼聚糖添加水平為1.0%和2.0%的組試驗(yàn)蝦血清中酚氧化酶 (PO)活性均較高,顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05),而添加水平為0.5%、3.0%的組PO活性顯著低于對(duì)照組和其余添加組 (P＜0.05);殼聚糖添加組試驗(yàn)蝦血清中的堿性磷酸酶 (ALP)活性均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05),其中添加水平為0.5%、2.0%的組ALP活性均較高;添加水平為2.0%的組血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)活性最高,顯著高于對(duì)照組(P＜0.05),其中添加水平為1.0、1.5、3.0的組ALT活性均顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05);殼聚糖添加組試驗(yàn)蝦血清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST)活性均顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05)。

表3 殼聚糖對(duì)克氏原螯蝦血清中相關(guān)非特異性免疫因子的影響Tab.3 Effects of dietary chitosan supplemention on non-specific immune factors in red swamp crayfish Procambarus clarkiiU/mL

2.3 克氏原螯蝦攝食不同含量殼聚糖飼料時(shí)的肌肉營養(yǎng)成分

從表4可見:對(duì)照組試驗(yàn)蝦肌肉的粗蛋白質(zhì)含量最高,除與殼聚糖添加水平為2.0%的組差異不顯著 (P＞0.05)外,與其他添加組均有顯著性差異 (P＜0.05);添加水平為1.0%、1.5%和3.0%的組試驗(yàn)蝦肌肉粗脂肪含量均較高,且顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05),分別較對(duì)照組提高了7.69%、7.69%和10.26%;添加水平為1.0%的組試驗(yàn)蝦肌肉灰分含量最低,且顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05),較對(duì)照組降低了3.57%,其余添加組均與對(duì)照組無顯著性差異 (P＞0.05);添加水平為0.5%、2.0%的組試驗(yàn)蝦肌肉水分含量均較高,且顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05)。

表4 殼聚糖對(duì)克氏原螯蝦肌肉營養(yǎng)成分的影響 (濕質(zhì)量)Tab.4 Effects of dietary chitosan supp lem ention on muscle composition in red swam p crayfish Procambarus clarkii w/%

2.4 克氏原螯蝦攝食不同含量殼聚糖飼料時(shí)肝胰腺和腸道中的消化酶活性

從表5可見:殼聚糖添加組試驗(yàn)蝦肝胰腺中的胰蛋白酶活性均顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05),其中添加水平為1.0%的組胰蛋白酶活性最高;添加水平為0.5%、1.5%和2.0%的組試驗(yàn)蝦腸道中的胰蛋白酶活性均顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05),添加水平為1.0%、3.0%的組胰蛋白酶活性均顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05);添加水平為1.5%的組試驗(yàn)蝦肝胰腺和腸道中的淀粉酶活性均最高,且顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05);添加水平為1.0%的組試驗(yàn)蝦肝胰腺和腸道中的脂肪酶活性均最高,且顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05)。

3 討論

3.1 殼聚糖對(duì)克氏原螯蝦特定生長(zhǎng)率和死亡率的影響

本試驗(yàn)中,克氏原螯蝦的特定生長(zhǎng)率呈先升高后降低的趨勢(shì),以1.0%殼聚糖添加組最高,其次是0.5%添加組。各組特定生長(zhǎng)率的變化不明顯,原因是所用試驗(yàn)蝦均為成蝦 (殼聚糖對(duì)克氏原螯蝦的生長(zhǎng)是否存在影響,用幼蝦進(jìn)行試驗(yàn)才能說明,另文報(bào)道)。當(dāng)殼聚糖添加水平為1.5%時(shí),死亡率顯著高于其他各組 (除2.0%添加組外)。添加水平為0.5% ～2.0%時(shí),都存在蛻殼后軟殼蝦的死亡現(xiàn)象,當(dāng)添加水平為3.0%時(shí)死亡率與對(duì)照組相同,均為0。有報(bào)道表明,甲殼動(dòng)物可利用飼料中的甲殼素,使其在蛻殼前期幾丁質(zhì)酶達(dá)到最高[10],從而促成蛻殼生長(zhǎng);而殼聚糖是甲殼素脫乙酰基后的多糖類產(chǎn)物,本試驗(yàn)結(jié)果表明,一定量的殼聚糖被克氏原螯蝦吸收利用后可促進(jìn)其幾丁質(zhì)酶的分泌,使其順利蛻殼生長(zhǎng)。飼料中殼聚糖添加水平為0.5% ～2.0%時(shí),克氏原螯蝦蛻殼后死亡率呈先升高后降低的趨勢(shì),其中添加水平為1.5%時(shí)克氏原螯蝦蛻殼率最高,同時(shí)死亡率也高于其他各組,這與蛻殼后的軟殼蝦抵抗力弱,易受到其他蝦的干擾和殘食有關(guān)。而對(duì)照組和3.0%添加組的克氏原螯蝦死亡率為0,這可能與對(duì)照組未添加殼聚糖,對(duì)克氏原螯蝦的蛻殼促進(jìn)作用小,蛻殼少,受到環(huán)境和其他蝦的干擾少有關(guān);3.0%添加組則可能是由于過量添加的殼聚糖吸附了飼料中的蛋白質(zhì),導(dǎo)致克氏原螯蝦消化吸收能力下降[11-12],從而抑制了其蛻殼,使自殘率降低?？紤]到殼聚糖對(duì)幾丁質(zhì)酶分泌有促進(jìn)作用,建議在克氏原螯蝦成蝦飼料配方中將殼聚糖的添加水平控制在0.5% ～1.5%。

表5 殼聚糖對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺和腸道中消化酶活性的影響Tab.5 Effects of dietary chitosan supplemention on digestive enzyme activities in hepatopancreas and intestine in red swamp crayfish Procambarus clarkiiU/mg

3.2 殼聚糖對(duì)克氏原螯蝦血清中相關(guān)免疫因子的影響

本研究中,1.0%～2.0%殼聚糖添加組克氏原螯蝦的PO活性較對(duì)照組均有所升高,其中2.0%添加組的PO活性顯著高于其他各組,說明殼聚糖可能會(huì)激活克氏原螯蝦的酚氧化酶原 (proPO)系統(tǒng),proPO被激活后產(chǎn)生一種酶[13],即酚氧化酶。已有研究表明,甲殼動(dòng)物的PO參與宿主的防御反應(yīng),一些多糖類物質(zhì)能激活proPO活化系統(tǒng)中的絲氨酸蛋白酶,從而活化PO[14-16]。ALP是甲殼動(dòng)物機(jī)體防御能力的重要組成部分,也是吞噬細(xì)胞殺菌的物質(zhì)基礎(chǔ)[17-18],本試驗(yàn)中,殼聚糖添加組試驗(yàn)蝦血清中的ALP活性均顯著高于對(duì)照組,3.0%添加組的ALP活性顯著低于其他添加組,但仍比對(duì)照組高,這與陳國福等[19]用A3α肽聚糖 (PG)拌餌投喂凡納濱對(duì)蝦60 d時(shí),飼喂0.05%PG的對(duì)蝦血清中的ALP活性最高,而0.10%PG組的ALP活性下降的結(jié)論相類似。從本試驗(yàn)結(jié)果看出, 1.0%～2.0%添加組的PO和ALP的活性均比較高,對(duì)克氏原螯蝦的免疫增強(qiáng)效果較好,說明殼聚糖可能會(huì)提高克氏原螯蝦抵抗外界病原菌的防御能力,降低死亡率。而1.0% ～2.0%添加組克氏原螯蝦的死亡率卻較對(duì)照組高,這可能與該添加量具有刺激幾丁質(zhì)酶的分泌,克氏原螯蝦蛻殼率較高,蛻殼后軟殼蝦被殘食有關(guān)。

本試驗(yàn)飼料中添加殼聚糖對(duì)克氏原螯蝦血清中ALT和AST活性的影響顯著,除殼聚糖添加量為2.0%的試驗(yàn)組ALT顯著高于對(duì)照組以及0.5%添加組ALT與對(duì)照組無顯著性差異外,其他添加組克氏原螯蝦血清中的ALT和AST均顯著低于對(duì)照組。ALT和AST是廣泛存在于動(dòng)物的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和線粒體中的重要氨基酸轉(zhuǎn)氨酶,常用來作為脊椎動(dòng)物以及對(duì)蝦肝胰腺功能的評(píng)估因子[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,飼料中添加殼聚糖可能對(duì)克氏原螯蝦的肝胰腺等組織起到了一定的保護(hù)作用,而2.0%添加組的ALT較高,可能是試驗(yàn)中操作誤差造成的。

3.3 殼聚糖對(duì)克氏原螯蝦肌肉營養(yǎng)成分的影響

一般來說,魚肉水分含量高,則粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量將會(huì)減少,魚肉品質(zhì)就差;反之,魚肉水分含量低,則粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量就高,魚肉品質(zhì)就好[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,殼聚糖添加組肌肉水分和灰分含量的變化不大,但蛋白質(zhì)含量略有下降,脂肪含量卻相應(yīng)升高,這與華雪銘等[22]在暗紋東方鲀飼料中單獨(dú)添加殼聚糖、益生菌和混合物的試驗(yàn)組蛋白質(zhì)含量普遍升高,脂肪含量普遍降低的結(jié)論不相一致。出現(xiàn)上述差異的原因是:殼聚糖的葡聚糖胺鏈中帶有4價(jià)銨離子,具有較高的陰離子交換能力,從而使帶正電性的殼聚糖能與帶負(fù)電性的膽汁酸結(jié)合并排出體外,阻止膽汁酸循環(huán),這樣可使食物中的脂肪不被乳化,減少脂肪的消化吸收,從而減少脂肪的沉淀積累[23]。魚類屬于脊椎動(dòng)物,食物中的脂肪由膽囊分泌的膽汁酸進(jìn)行消化,殼聚糖與脊椎動(dòng)物膽囊分泌的膽汁酸結(jié)合阻礙了脂肪的消化,進(jìn)而降低了魚體脂肪的含量。而克氏原螯蝦為無脊椎動(dòng)物,食物中的營養(yǎng)物質(zhì)由肝胰腺及消化道分泌的消化酶進(jìn)行消化,本試驗(yàn)中殼聚糖添加組克氏原螯蝦肌肉中的脂肪含量升高,與添加殼聚糖后克氏原螯蝦的脂肪酶升高相符合,說明殼聚糖能降低魚類肌肉脂肪含量的結(jié)論可能不適用于無脊椎動(dòng)物。

3.4 殼聚糖對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺及腸道中消化酶的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明,各殼聚糖添加組消化酶活性大體上隨著殼聚糖添加量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),1.0%添加組克氏原螯蝦肝胰腺中的胰蛋白酶活性最高,較對(duì)照組提高了161.38%;1.5%和2.0%添加組腸道中的胰蛋白酶活性均較高,分別較對(duì)照組提高了33.72%和43.69%;1.0%組試驗(yàn)蝦肝胰腺和腸道中的脂肪酶活性分別較對(duì)照組提高了62.54%和137.99%;1.5%添加組蝦肝胰腺和腸道中的淀粉酶活性均最高,分別較對(duì)照組提高了26.92%和2.63%,說明殼聚糖提高了克氏原螯蝦的消化酶活性。這與華雪銘等[22]在暗紋東方鲀幼魚的飼料中添加0.2%的殼聚糖能顯著提高腸道淀粉酶活性的結(jié)果相似,原因是殼聚糖被試驗(yàn)動(dòng)物攝取后,可能調(diào)節(jié)了腸道微生態(tài)平衡[24],推測(cè)殼聚糖被克氏原螯蝦攝入,經(jīng)口腔、胃等到達(dá)腸道后,可以選擇性地增殖某些有益菌,這些有益菌能促進(jìn)腸道完整性,提高腸道自身分泌消化酶的功能。同時(shí)又可以在腸道內(nèi)合成維生素和氨基酸,達(dá)到提高水產(chǎn)動(dòng)物的營養(yǎng),從而使殼聚糖起到間接提高消化酶活性的作用。消化酶活性的變化與PO、ALP、轉(zhuǎn)氨酶的變化相符合,隨著殼聚糖添加量的增加,消化酶活性有所上升,PO、ALP活性也升高,轉(zhuǎn)氨酶的活性則相應(yīng)降低?？梢钥闯?消化酶活性升高,提高了克氏原螯蝦對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的利用率,促進(jìn)了免疫因子的活化,增強(qiáng)了機(jī)體抵御外界不利因子的能力。

上述試驗(yàn)結(jié)果表明,在成蝦飼料中添加0.5%～1.5%的殼聚糖,并不會(huì)影響蝦肉的品質(zhì),而且對(duì)克氏原螯蝦具有一定的免疫保護(hù)和增強(qiáng)其消化機(jī)能的作用。

[1] 鄭宗林,唐俊,喻文娟.殼聚糖在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用及前景展望[J].漁業(yè)現(xiàn)代化,2004(5):40-42.

[2] Anderson D P,Siwicki A K.Duration of protection againstAeromonas salmonicidain brook trout immunostimulated with glucan or chitosan by injection or immersion[J].Progr Fish Cult,1994,56: 258-261.

[3] Siwicki A K,Anderson D P,Rumsey G L.Dietary intake of immunostimulants by rainbow trout affects non-specific immunity and protection against furunculosis[J].Veterinary Immunology and Immunopathology,1994,41(1/2):125-139.

[4] Esteban M A,Mulero V,Cuesta A,et al.Effects of injecting chitin particles on the innate immune response of gilthead seabream (Sparus aurataL.)[J].Fish&Shellfish Immunology,2000,10 (6):543-554.

[5] Esteban M A,Cuesta A,Ortuno J,et al.Immunomodulatory effects of dietary intake of chitin on gilthead seabream(Sparus aurataL.)innate immune system[J].Fish&Shellfish Immunology, 2001,11(4):303-315.

[6] Wang SH,Chen JC.The protective effectof chitin and chitosan againstVibrio alginolyticusin white shrimpLitopenaeus vannamei[J].Fish&Shellfish Immunology,2005,19(3):191-204.

[7] 王建國,陸宏達(dá).酚氧化酶活力測(cè)定方法中關(guān)于測(cè)定時(shí)間的研究[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2009,18(6):765-770.

[8] Huang J,Yang Y,Wang A.Reconsideration of phenoloxidase activity determination in white shrimpLitopenaeus vannamei[J].Fish& Shellfish Immunology,2010,28(1):240-244.

[9] 董學(xué)興,呂林蘭,黃金田,等.Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)對(duì)克氏原螯蝦代謝酶的影響[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2011,26(5):467-471.

[10] Tan S H,Degnan B M,Lehnert S A.The penaeus monodon chitinase 1 gene is differentially expressed in the hepatopancreas during the molt cycle[J].Marine Biotechnology,2000,2(2): 126-135.

[11] Shiau S Y,Yu Y P.Dietary supplementation of chitin and chitosan depresses growth in tilapia,Oreochromisniloticus×O.aureus[J].Aquaculture,1999,179:439-446.

[12] Kono M,Matsui T,Shimizu C.Effect of chitin,chitosan and cellulose as diet supplementson the growth of cultured fish[J].Bull Japan Soc Scient Fish,1987,53(1):125-129.

[13] 黃輝洋,李少菁,王桂忠,等.甲殼動(dòng)物酚氧化酶活力及其在養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].海洋通報(bào),2000,19(3):79-84.

[14] Aspan A,Soderhall K.Purification of prophenoloxidase from crayfish blood cells,and its activation by an ecdogenous serine proteinase[J].Insect Biochem,1991,21:363-373.

[15] Aspan A,Sturtevant J,JSmith V,etal.Purification and characterization of a prophenoxidase activating enzyme from crayfish blood cells[J].Insect Biochem,1990,20:709-718.

[16] Soderhall K,Hall L.Lipopolysaccharide-induced activation of prophenoloxidase activation system in crayfish haemocyte lysate [J].Biochim Biophys Acta,1984,79(7):99-104.

[17] 肖克宇.水產(chǎn)動(dòng)物免疫與應(yīng)用[M].北京:科學(xué)出版社,2007: 102-138.

[18] 何南海.對(duì)蝦免疫功能指標(biāo)的建立及其應(yīng)用[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2004,23(3):385-388.

[19] 陳國福,宋曉玲,黃倢.A3α肽聚糖對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、免疫機(jī)能和抗病毒感染的影響[J].高技術(shù)通訊,2005,15(8): 100-106.

[20] Chaplin A E,Huggins A K,Munday K A.The distribution of lα-aminotransferases inCarcinusmaenas[J].Comparative Biochemistry and Physiology,1967,20(1):195-198.

[21] 曹丹,周洪琪.殼聚糖對(duì)異育銀鯽的生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)合成及肌肉營養(yǎng)成分的影響[J].淡水漁業(yè),2004,34(1):6-11.

[22] 華雪銘,周洪琪,張宇峰,等.飼料中添加殼聚糖和益生菌對(duì)暗紋東方鲀幼魚生長(zhǎng)及部分消化酶活性的影響[J].水生生物學(xué)報(bào),2005,29(3):299-307.

[23] 王樹芹,張成松.甲殼素、殼聚糖及其在水產(chǎn)中的應(yīng)用[J].飼料研究,2004(5):25-28.

[24] Mitsuaki K.Properties and uses of oligosaccharides from chitin and chitosan[J].JAppl Glycoscience,1998,45(4):415-419.

Effects of dietary chitosan supplementation on growth,non-specific immune factors,muscle com positions and activities of digestive enzymes in red swamp crayfish Procambarus clarkii

REN Xiu-fang1,2,ZHOU Xin2,ZHAO Chao-yang2,SHUI Yan2,XU Zeng-hong2, SHEN Huai-shun2,ZHANG Ping1,2,BAIAi-xu1,2
(1.College of Fisheriesand Life,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;2.Freshwater Fisheries Research Center,Chinese Academy of Fishery Sciences,Wuxi214081,China)

Red swamp crayfishProcambarus clarkiiwith initial body weight of(21.55±1.62)g were fed the diets containing 0%(control group),0.5%,1.0%,1.5%,2.0%,and 3.0%chitosan atwater temperature of(22± 1)℃ for 60 days to investigate the effects of dietary chitosan supplementation on growth,non-specific immune factors,muscle compositions,and activity of digestive enzymes in the red swamp crayfish.Results showed that there was significantly higher specific growth rate in the crayfish in 1.0%chitosan group than that in the other groups (P＜0.05).The mortality rate and molting mortality rate were found to be significantly higher in the crayfish in 1.5% chitosan group than those in the control one(P＜0.05).The crayfish fed the diets containing 1.0%and 2.0% chitosan had significantly higher phenoloxidase activity than the crayfish in the control group did(P＜0.05). There were significantly higher alkaline phosphatase(ALP)activity in the chitosan addition groups than those in the control group(P＜0.05).The chitosan addition led to significantly lower glutamic-pyruvic transaminase (ALT),except in 1.0% and 2.0% chitosan groups.The significantly lower glutamic-oxalacetic transaminease (AST)activitieswere observed in chitosan addition groups(P＜0.05),except 2.0% chitosan addition group. Muscle composition analysis indicated that there was lower crude protein level in the chitosan addition groups than that in the control group,while there was significantly higher crude fat level in the 1.0%,1.5%,and 3.0% groups than that in the control one(P＜0.05),except in 2.0% chitosan group.The crayfish fed the diet containing 1.0% chitosan showed significantly lower ash content inmuscle than the crayfish in the control group did.Therewas significantly highermoisture in 2.0% chitosan group than that in the control group(P＜0.05).The significantly higher activities of trypsase and lipase in hepatopancreas and trypsin in intestinal tractwere found in the 1.0% chitosan group(P＜0.05)compared with the control group.The crayfish fed the diet1.5% chitosan had significantly higher amylase activities in hepatopancreas and intestine than the animals fed the control diet did(P＜0.05).In conclusion,it is suggested that chitosan addition of 0.5%-1.5%improve the immune protection and promote digestive function in red swamp crayfish.

Procambarus clarkii;chitosan;phenoloxidase;digestive enzyme;muscle composition

S966.1

A

2095-1388(2013)05-0468-07

2013-02-05

農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)與種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目;公益性行業(yè) (農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng) (201003070)

任秀芳 (1987-),女,碩士研究生。E-mail:greatrxf@163.com

周鑫 (1956-),男,研究員。E-mail:zhoux@ffrc.cn