王 丹，趙廣華，趙曉燕,*

(1. 北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心，農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，

農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點實驗室，北京 100097；2.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083)

臘八蒜是我國傳統(tǒng)的蒜制品，綠色素是其呈色物質(zhì)。近年來研究表明大蒜綠色素形成的中間體為吡咯基氨基酸類物質(zhì)，其與丙酮酸反應(yīng)生成黃色素，與烯丙基硫代亞磺酸酯反應(yīng)生成藍色素[1-3]。這些色素形成的反應(yīng)均為非酶反應(yīng)，消耗的較慢，色素中間體在臘八蒜的產(chǎn)品中始終存在[4]，因此對其進行生物活性評價，能夠增加大蒜的附加值。

醋大蒜比鮮蒜的抑菌作用更穩(wěn)定，醋蒜的醇提物及醋蒜浸泡液均具有較好的抑菌活性[5]。此外，色素提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及釀酒酵母菌也有一定的抗菌活性，其中對大腸桿菌的抑菌效果最好，對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最弱，蒜醋使高膽固醇飼養(yǎng)的大鼠體質(zhì)量明顯下降，血液中的甘油三酸酯的含量降低[6-11]。然而目前主要研究了醋蒜及色素提取物的活性，此外前期的研究表明色素中間體不僅是色素形成的關(guān)鍵物質(zhì)，還具有清除DPPH自由基、ABTS＋·的作用[12]，并且色素中間體的結(jié)構(gòu)如吡咯基甘氨酸與苯甲酸相似(圖1)，苯甲酸是目前常用的很好的防腐劑，從結(jié)構(gòu)上分析具有抑菌的可能性，然而其抑菌性如何，未見文獻報道。本實驗主要對其抑菌活性進行研究，并研究4種臘八蒜色素中間體——吡咯基甘氨酸(P-Gly)、吡咯基丙氨酸(P-Ala)、吡咯基纈氨酸(P-Val)、吡咯基亮氨酸(P-Leu)抑制枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的能力，以期為臘八蒜保健功能的驗證提供理論依據(jù)，增加其附加值。

圖 1 色素中間體——吡咯基氨基酸及苯甲酸的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of four pyrrolyl amino acids and benzoic acid

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

大腸桿菌及枯草芽孢桿菌 中國科學院微生物菌種保藏中心。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 北京奧博星生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸(均為分析純)北京欣經(jīng)科試劑公司；2,5-二甲氧基四氫呋喃(色譜純)美國Fluka公司；冰醋酸、鹽酸、無水乙酸鈉、無水硫酸鈉、氫氧化鉀、乙酸乙酯、活性碳(分析純) 北京化學試劑公司.

85-2型恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；868型pH計 美國奧立龍公司；SENCO R-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申順生物科技有限公司；Carry 50紫外-可見分光光度計 美國瓦里安公司；DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1FD型無菌操作臺 蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司；ZDX-35BI型自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 微生物標準曲線的繪制及菌懸液的制備

標準曲線的繪制：無菌操作下降斜面保藏的枯草芽孢桿菌、大腸桿菌接種于已制好滅菌過的營養(yǎng)瓊脂斜面上，接種后于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，連續(xù)培養(yǎng)兩代。制備0.85%的無菌生理鹽水，在無菌操作下將已經(jīng)活化2次的枯草芽孢桿菌、大腸桿菌洗下，振蕩使菌體分布均勻。采用平板菌落計數(shù)法計數(shù)細菌，計算出原菌液的菌體濃度，在此基礎(chǔ)上稀釋合適的倍數(shù)，測定各濃度對應(yīng)的OD560nm值。以不同稀釋度的菌落數(shù)為縱坐標，OD560nm值為橫坐標做曲線，枯草芽孢桿菌：y=641.1x+3.9(R2=0.98)，大腸桿菌：y=284.9x+18.6(R2=0.97)。

菌懸液的制備：測定菌懸液的OD560nm，并在標準曲線上找出相應(yīng)的菌濃后，用0.85%的生理鹽水稀釋該菌懸液，調(diào)節(jié)至一定菌濃。

1.3.2 色素中間體——吡咯基氨基酸的制備

[12-16]方法，本實驗室自制4種色素中間體：吡咯基甘氨酸、吡咯基丙氨酸、吡咯基纈氨酸及吡咯基亮氨酸。具體如下：100mL冰乙酸中溶解10g無水乙酸鈉，加入甘氨酸(0.0544mol)，溶解后加入2,5-二甲氧基四氫呋喃(0.0544mol)回流40min，降到室溫，加500mL冰水，過濾，活性炭脫色。乙酸乙酯萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。10g/100mL氫氧化鉀溶解濃縮液，用2mol/L的鹽酸調(diào)pH值到1～2，0～4℃條件下過夜，過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，加入無水硫酸鈉靜置10h去除水分，旋轉(zhuǎn)蒸干，所得物質(zhì)即為吡咯基甘氨酸。除了原料采用相應(yīng)的氨基酸外，吡咯基丙氨酸、吡咯基纈氨酸與吡咯基甘氨酸合成步驟相同。吡咯基亮氨酸在用2mol/L的鹽酸調(diào)pH值到1～2時，出現(xiàn)油狀液滴，收集即為吡咯基亮氨酸。

1.3.3 抑菌實驗

大腸桿菌及枯草芽孢桿菌配制106的菌懸液，接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固，在培養(yǎng)皿上放置牛津杯，每個牛津杯中加入20μL不同濃度的吡咯基氨基酸(10、20、30、40mmol/L)，在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，測量抑菌圈直徑大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 吡咯基氨基酸抑制枯草芽孢桿菌的能力

不同濃度吡咯基甘氨酸(10、20、30、40mmol/L)抑制枯草芽孢桿菌的結(jié)果見圖1，其中縱坐標是抑菌圈的直徑，直徑越大說明抑菌的能力越強。

圖 2 不同濃度吡咯基甘氨酸抑制枯草芽孢桿菌的能力Fig.2 Inhibitory activity of P-Gly at different concentrations against Bacillus subtilis

由圖2可見，吡咯基甘氨酸具有一定的抑制枯草芽孢桿菌的能力，10mmol/L時就能體現(xiàn)一定的抑菌性，且濃度越大抑菌能力越強。其他的吡咯基氨基酸與吡咯基甘氨酸一樣，也具有一定的抑制枯草芽孢桿菌的能力(結(jié)果未列出)。

不同的吡咯基氨基酸具有不同的極性及結(jié)構(gòu)，為研究其抑菌能力的差異，本研究以苯甲酸作為對照，進一步比較了以上4種吡咯基氨基酸的抑制枯草芽孢桿菌的能力。相同濃度(20mmol/L)的不同吡咯基氨基酸抑制枯草芽孢桿菌能力的比較見圖3。

圖 3 不同吡咯基氨基酸抑制枯草芽孢桿菌的能力Fig.3 Inhibitory activity of four pyrrolyl amino acids against Bacillus subtilis

由圖3可知，所有樣品均有一定的抑制枯草芽孢桿菌的能力，其中吡咯基亮氨酸抑菌能力最強，其次是吡咯基甘氨酸，此兩種物質(zhì)較苯甲酸的抑菌能力更強，吡咯基丙氨酸的抑菌能力與苯甲酸相當，吡咯基纈氨酸的抑菌能力相對苯甲酸較差。

苯甲酸的抑菌機理是它的分子能抑制微生物細胞呼吸酶系統(tǒng)活性，特別是對乙酰酶縮合反應(yīng)有很強的抑制作用。在高酸性食品中殺菌效力為微堿性食品的100倍，苯甲酸以未被解離的分子態(tài)才有防腐效果，可見pH值對抑菌的效果具有重要影響。苯甲酸抗菌有效性的最適pH值在2.5～4.0之間，pH值為3.5時，0.125%的溶液在1h內(nèi)可殺死金黃色葡萄球菌和其他菌；然而pH值為5時，即使5%的濃度溶液殺菌效果也不可靠，由此可見pH值是影響某些防腐劑抑菌效果的重要因素。

根據(jù)前期的研究方法，采用標定法測定pKa值。將4種吡咯基氨基酸分別配制成不同的濃度，25℃測定其pKa值，可求得一系列的值，取其平均值，即為該溫度條件下的pKa。吡咯基甘氨酸、吡咯基丙氨酸、吡咯基纈氨酸、吡咯基亮氨酸的pKa值見表1。所有吡咯基氨基酸均為一元弱酸，可以看成是乙酸的類似物。由表1可知，這些化合物的pKa值在3.45～3.91之間，比乙酸(4.75)低，表明其酸性比乙酸強。且此4種化合物的pKa值大小順序為吡咯基亮氨酸(3.45)＜吡咯基甘氨酸(3.55)＜吡咯基丙氨酸(3.65)＜吡咯基纈氨酸(3.91)，觀察規(guī)律發(fā)現(xiàn)此順序正好與4種化合物的抑制枯草芽孢桿菌強弱的順序相反：吡咯基亮氨酸＞吡咯基甘氨酸＞吡咯基丙氨酸＞吡咯基纈氨酸?？梢妏Ka值越低抑制枯草芽孢桿菌的能力越強。

表 1 吡咯基氨基酸的pKa值Table 1 pKa values of four pyrrolyl amino acids

2.2 吡咯基氨基酸抑制大腸桿菌的能力

圖 4 不同濃度吡咯基甘氨酸抑制大腸桿菌的能力Fig.4 Inhibitory activity of P-Gly at different concentrations against Escherichia coli

由圖4可知，高濃度的吡咯基甘氨酸具有一定的抑制大腸桿菌的能力，10mmol/L的濃度不能抑制大腸桿菌(結(jié)果未顯示)。與枯草芽孢桿菌相比，抑制大腸桿菌能力較小。進一步研究其他色素中間體抑制大腸桿菌的情況。

圖 5 不同吡咯基氨基酸抑制大腸桿菌的能力Fig.5 Inhibitory activity of four pyrrolyl amino acids against Escherichia coli

圖5為濃度20mmol/L的不同結(jié)構(gòu)的色素中間體抑制大腸桿菌的情況，由此可知，吡咯基亮氨酸同樣具有最強的抑菌能力，然而其他3種化合物的抑制大腸桿菌能力與抑制枯草芽孢桿菌的能力不同，吡咯基纈氨酸的抑菌能力增強，吡咯基丙氨酸與吡咯基甘氨酸的抑菌能力沒有顯著差異?？梢娨种拼竽c桿菌的能力與其pKa值沒有相關(guān)性。然而由結(jié)果可見，色素中間體的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)越大(吡咯基亮氨酸＞吡咯基纈氨酸＞吡咯基丙氨酸＞吡咯基甘氨酸)，極性越弱，抑制大腸桿菌的能力越強(吡咯基亮氨酸＞吡咯基纈氨酸＞吡咯基丙氨酸≈吡咯基甘氨酸)?？赡苁怯捎谏刂虚g體的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)越大，脂溶性越強，與細菌細胞膜中磷脂分子和脂多糖等成分互作的能力越強，破壞膜穩(wěn)定，從而抑制細菌生長的能力越強[17]。由此可見色素中間體抑制細菌的能力與其pKa值和結(jié)構(gòu)的脂溶性程度有關(guān)，因為大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，細胞壁比較復(fù)雜，但肽聚糖層薄，較為脆弱，因此色素中間體的結(jié)構(gòu)(脂溶性)對其抑菌影響較大，而枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽性菌，細胞壁肽聚糖層較厚，使其細胞壁機械強度強而飽滿，因此，色素中間體的pKa值對其抑菌影響更大。

3 結(jié) 論

臘八蒜色素中間體具有一定的抑制枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的能力；此中間體抑制枯草芽孢桿菌的能力強于大腸桿菌；色素中間體的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)和pKa值影響其抑菌能力，其中，pKa值是影響其抑制枯草芽孢桿菌的主要因素，而側(cè)鏈結(jié)構(gòu)是影響其抑制大腸桿菌的主要因素。

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