半連續(xù)發(fā)酵及其應(yīng)用研究進(jìn)展

孫文敬，劉長(zhǎng)峰，周延政，王大明，崔鳳杰，余 琳

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江西省生物發(fā)酵食品添加劑工程技術(shù)研究中心，江西 德興 334221；3.百勤異VC鈉有限公司，江西 德興 334221；4.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050016)

半連續(xù)發(fā)酵及其應(yīng)用研究進(jìn)展

孫文敬1,2，劉長(zhǎng)峰1,2，周延政2,3，王大明4，崔鳳杰1,2，余 琳1,2

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江西省生物發(fā)酵食品添加劑工程技術(shù)研究中心，江西 德興 334221；3.百勤異VC鈉有限公司，江西 德興 334221；4.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050016)

半連續(xù)發(fā)酵是一種重要的生化培養(yǎng)方式。本文介紹半連續(xù)發(fā)酵的應(yīng)用領(lǐng)域，詳細(xì)綜述半連續(xù)發(fā)酵的分類、特點(diǎn)、與連續(xù)發(fā)酵的聯(lián)系以及半連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中的菌體循環(huán)利用方法，并結(jié)合當(dāng)前代謝工程和過(guò)程控制策略的發(fā)展趨勢(shì)，對(duì)半連續(xù)發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

半連續(xù)發(fā)酵；研究現(xiàn)狀；應(yīng)用領(lǐng)域；展望

半連續(xù)發(fā)酵(semi-continuous fermentation)，又稱半連續(xù)培養(yǎng)、反復(fù)分批培養(yǎng)或換液培養(yǎng)，是指在分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，周期性地放出部分含有產(chǎn)物的發(fā)酵液，然后再補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基的發(fā)酵方法。在實(shí)施半連續(xù)發(fā)酵的操作過(guò)程中，補(bǔ)充了新?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分的反應(yīng)體系的培養(yǎng)條件與分批培養(yǎng)條件相同，且反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積基本保持不變[1]。半連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)已在工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域逐步得到應(yīng)用，但與其相關(guān)的整合性論述卻很少。本文主要綜述半連續(xù)發(fā)酵過(guò)程以及操作工藝的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀，以期為該工藝更廣泛的應(yīng)用提供參考。

1 半連續(xù)發(fā)酵的應(yīng)用范圍

半連續(xù)發(fā)酵技術(shù)在工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究中已經(jīng)得到了比較廣泛的應(yīng)用，主要涉及菌體的生產(chǎn)、微生物代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)、垃圾的厭氧消化和動(dòng)物消化道內(nèi)微生物的體外培養(yǎng)。

1.1 菌體的生產(chǎn)

對(duì)于部分微藻的培養(yǎng)，無(wú)論是在規(guī)?；a(chǎn)中還是在實(shí)驗(yàn)室研究中，半連續(xù)培養(yǎng)模式都是常用的模式之一[2-5]。在微藻的半連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)液的更新率對(duì)菌體生長(zhǎng)和細(xì)胞內(nèi)生化組分都有重要影響，是一個(gè)比較關(guān)鍵的參數(shù)[6]。

1.2 微生物代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)

應(yīng)用半連續(xù)培養(yǎng)工藝規(guī)?；a(chǎn)微生物代謝產(chǎn)物的實(shí)例主要有：醋酸、青霉素和酒精。

1.2.1 醋酸

采用深層液體發(fā)酵工藝生產(chǎn)醋酸，醋酸的生成速率主要取決于醋酸菌的生長(zhǎng)速率和活菌體濃度[7]。在連續(xù)培養(yǎng)體系中，由于醋酸菌的比生長(zhǎng)速率較低以及環(huán)境中高濃度醋酸的存在，導(dǎo)致了比產(chǎn)物生成速率較低，因此高產(chǎn)酸率和高濃度的醋酸發(fā)酵不宜采用連續(xù)發(fā)酵工藝[7]。在醋酸的規(guī)?；a(chǎn)中，目前廣泛采用的是半連續(xù)發(fā)酵工藝[8]。以德國(guó)Heinrich Frings公司為例，其醋酸生產(chǎn)的基本工藝流程如下：當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至乙醇質(zhì)量濃度接近于0時(shí)，放出40%的發(fā)酵液，然后加入等體積的新鮮酒醪進(jìn)行再發(fā)酵，并保持整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中通氣和溫度的恒定，醋酸的質(zhì)量濃度可以達(dá)到13.3g/100mL。如果新鮮酒醪的添加方式正確和放罐時(shí)機(jī)掌握恰當(dāng)，能夠有效縮短下個(gè)周期發(fā)酵的延滯期，直接進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期[7]。

有關(guān)多級(jí)半連續(xù)發(fā)酵、發(fā)酵過(guò)程的控制和耐高濃度醋酸菌種的應(yīng)用等相關(guān)研究[9-11]也有報(bào)道，其主要目的在于進(jìn)一步提高發(fā)酵液中的產(chǎn)物濃度。

1.2.2 青霉素

青霉素被發(fā)現(xiàn)后的數(shù)10年間，該產(chǎn)品的生產(chǎn)技術(shù)得到了迅猛發(fā)展[12]。最初的青霉素半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)純粹是依據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行控制的[13]，但對(duì)于這樣一個(gè)時(shí)變性和非線性的復(fù)雜發(fā)酵過(guò)程，僅僅依靠經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行控制不能滿足現(xiàn)代化生產(chǎn)的要求[14]，為此許多學(xué)者致力于實(shí)現(xiàn)青霉素半連續(xù)發(fā)酵過(guò)程的模型化及在此基礎(chǔ)上實(shí)行的優(yōu)化控制研究[15-17]。

發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究表明，比生長(zhǎng)速率為0.015h-1時(shí)青霉素生產(chǎn)菌的生產(chǎn)能力最強(qiáng)。該研究結(jié)果應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，就形成了目前青霉素發(fā)酵工業(yè)中普遍采用的半連續(xù)流加發(fā)酵工藝，我國(guó)工業(yè)界通俗地稱其為青霉素發(fā)酵帶放工藝[18]。

青霉素半連續(xù)發(fā)酵工藝的大致操作為：達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，放出20%～40%的發(fā)酵液進(jìn)入后續(xù)的提取工藝，同時(shí)補(bǔ)充相同體積的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵，這種操作可以反復(fù)進(jìn)行多次而不會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量減少，還能增加發(fā)酵罐的體積利用率[19]。徐猛[20]報(bào)道了另一種半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)青霉素的方法，即將青霉素半連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中帶放的發(fā)酵液，通過(guò)管道轉(zhuǎn)移到另一個(gè)無(wú)菌發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料再培養(yǎng)，直至青霉菌進(jìn)入自溶階段。該方法充分利用了處于穩(wěn)定期青霉菌的次級(jí)代謝能力，明顯縮短了生產(chǎn)周期，有效降低了生產(chǎn)成本。

1.2.3 酒精

酒精的規(guī)模化生產(chǎn)目前主要采用連續(xù)濃醪發(fā)酵工藝，尤其是年產(chǎn)幾十萬(wàn)噸的大型生產(chǎn)企業(yè)。一般在4～6級(jí)連續(xù)發(fā)酵工藝中，通過(guò)減少整體返混的方式來(lái)緩解產(chǎn)物抑制[21]。有關(guān)采用半連續(xù)發(fā)酵工藝生產(chǎn)酒精的研究也有報(bào)道，如劉曉峰等[22]在特大型發(fā)酵罐生產(chǎn)酒精的過(guò)程中，從設(shè)備投資和雜菌污染控制等方面對(duì)連續(xù)發(fā)酵工藝與半連續(xù)發(fā)酵工藝進(jìn)行了比較，得出了在特大型發(fā)酵罐中采用半連續(xù)發(fā)酵工藝生產(chǎn)酒精更為合理的結(jié)論。表華偉[23]認(rèn)為，半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)酒精，一方面相對(duì)于分批發(fā)酵而言提高了設(shè)備利用率，縮短了發(fā)酵周期；另一方面為將來(lái)的連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)酒精打下了基礎(chǔ)，以便整個(gè)酒精生產(chǎn)流程實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制。岳國(guó)君等[24]對(duì)酒精的生產(chǎn)技術(shù)做過(guò)評(píng)述，認(rèn)為國(guó)外企業(yè)在生產(chǎn)酒精的過(guò)程中，通過(guò)將多級(jí)連續(xù)發(fā)酵工藝、同步糖化發(fā)酵工藝以及酵母的自絮凝技術(shù)相結(jié)合，顯著降低了成本，優(yōu)于國(guó)內(nèi)企業(yè)多采用的半連續(xù)發(fā)酵工藝。

除醋酸、青霉素和酒精之外，尚有許多微生物代謝產(chǎn)物已在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上實(shí)現(xiàn)了半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)，其生產(chǎn)效率遠(yuǎn)高于現(xiàn)有的分批發(fā)酵或補(bǔ)料分批發(fā)酵模式，如乳酸[25]、富馬酸[26]、甘油[27]、脂肪酶[28]、二羥丙酮[29-30]等。對(duì)于這些代謝產(chǎn)物，實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中是否采用半連續(xù)發(fā)酵工藝應(yīng)結(jié)合具體情況綜合考慮。John等[31]對(duì)以工農(nóng)業(yè)廢物為原材料的乳酸發(fā)酵生產(chǎn)進(jìn)行過(guò)評(píng)述：除了生產(chǎn)強(qiáng)度外，在其他技術(shù)指標(biāo)上分批發(fā)酵工藝均優(yōu)于連續(xù)發(fā)酵工藝；相對(duì)于分批發(fā)酵工藝而言，采用半連續(xù)發(fā)酵工藝可進(jìn)一步提高發(fā)酵產(chǎn)率。因此，在原材料成本相對(duì)較高的情況下，應(yīng)采用半連續(xù)發(fā)酵工藝使產(chǎn)率最大化；在設(shè)備及能耗成本相對(duì)較高的情況下，應(yīng)采用連續(xù)發(fā)酵工藝使生產(chǎn)強(qiáng)度最大化。

1.3 垃圾的厭氧消化

垃圾的厭氧消化是指在厭氧微生物的作用下，垃圾中的有機(jī)物發(fā)生降解并趨于穩(wěn)定的過(guò)程，該過(guò)程由水解產(chǎn)酸階段和厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣階段組成[32]。目前，垃圾的厭氧生物處理方式較多，其中也包括半連續(xù)操作模式，如Wang等[33]分別在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模和實(shí)際生產(chǎn)規(guī)模中，對(duì)分批操作模式和半連續(xù)操作模式下甲烷的生產(chǎn)強(qiáng)度和揮發(fā)性固體的轉(zhuǎn)移量進(jìn)行了比較。由于半連續(xù)操作模式下污泥的穩(wěn)定性更高，因此其生產(chǎn)效率相對(duì)高于分批操作模式。Kearney等[34]研究了半連續(xù)厭氧消化過(guò)程中大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌等幾種菌的活性，為高效進(jìn)行厭氧消化提供了一定的參考。李來(lái)慶等[35]建立了番茄廢物半連續(xù)厭氧消化的動(dòng)力學(xué)模型，能夠用于蔬菜廢物半連續(xù)厭氧消化過(guò)程的參數(shù)優(yōu)化，并可以為該項(xiàng)技術(shù)的工程應(yīng)用提供一定的理論指導(dǎo)。

1.4 動(dòng)物消化道內(nèi)微生物的體外培養(yǎng)

早在20世紀(jì)50年代，國(guó)外就開(kāi)展了利用體外系統(tǒng)模擬胃腸生態(tài)系統(tǒng)的相關(guān)研究。1963年，Rufener等[36]提出連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)可以用于模擬瘤胃微生物系統(tǒng)；20世紀(jì)80年代以來(lái)，有報(bào)道[37-38]認(rèn)為采用半連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)模擬腸道微生物系統(tǒng)能夠取得更好的效果。在研究腸道菌群對(duì)異型生物質(zhì)毒性的解除作用過(guò)程中，Campbell等[37]認(rèn)為連續(xù)培養(yǎng)與半連續(xù)培養(yǎng)的區(qū)別主要在于營(yíng)養(yǎng)物添加和廢物移除的方式不同，連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)雖然能夠提供相對(duì)恒定水平的營(yíng)養(yǎng)物，使微生物保持在穩(wěn)定的狀態(tài)，但回腸內(nèi)的流質(zhì)卻是以類似脈沖的方式進(jìn)入大腸，半連續(xù)培養(yǎng)模式與之更為相似，因此更適合于腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)的模擬。

2 半連續(xù)發(fā)酵的特點(diǎn)

微生物發(fā)酵可分為分批、補(bǔ)料分批、半連續(xù)、連續(xù)等多種模式。分批發(fā)酵的人力、物力消耗較大，每批發(fā)酵都需要進(jìn)行裝料、滅菌、接種、放料、清洗等操作，工序繁瑣，發(fā)酵周期較長(zhǎng)，生產(chǎn)效率較低；補(bǔ)料分批發(fā)酵雖可通過(guò)補(bǔ)料補(bǔ)充養(yǎng)分或前體的不足，但是由于有害代謝產(chǎn)物的不斷積累，產(chǎn)物合成最終難免受到阻遏；連續(xù)發(fā)酵較分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度大大提高，但容易遭受雜菌的污染，菌種易退化，設(shè)備投資較大，且發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低；半連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)放掉部分發(fā)酵液再補(bǔ)入新鮮培養(yǎng)基，不僅可以補(bǔ)充養(yǎng)分和前體，而且代謝有害物被稀釋，從而有利于產(chǎn)物的繼續(xù)合成[39]。半連續(xù)發(fā)酵工藝的應(yīng)用可以起到緩解產(chǎn)物抑制和避免代謝副產(chǎn)物積累的作用，改善了微生物的培養(yǎng)環(huán)境，有助于保持菌體活力的穩(wěn)定，這也使其在某些初級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)過(guò)程中得到了應(yīng)用，如醋酸[8]、乙醇[22]和乳酸[25]等。

對(duì)于某些次級(jí)代謝產(chǎn)物如青霉素[40]、赤霉素[41]、環(huán)孢菌素[42]和洛伐他汀[43]等，其最高的生產(chǎn)速率僅在某些瞬態(tài)條件下才能達(dá)到。采用半連續(xù)發(fā)酵工藝不僅可以使這種瞬態(tài)條件反復(fù)出現(xiàn)，而且還可以提高設(shè)備的利用率，因此半連續(xù)發(fā)酵工藝在次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)方面有著重要的應(yīng)用[44]。

除適合于動(dòng)物消化道內(nèi)微生物的體外培養(yǎng)[37]外，半連續(xù)培養(yǎng)模式還能滿足一些特殊微生物的培養(yǎng)要求。Manu等[45]在研究厭氧條件下污泥對(duì)靛類染料和偶氮染料廢水的脫色作用時(shí)指出，水流停留時(shí)間對(duì)脫色效率有關(guān)鍵影響。相對(duì)于其他的操作方式，采用半連續(xù)操作方式可以同時(shí)達(dá)到更長(zhǎng)的水流停留時(shí)間和更高濃度的生物量，因此該操作模式比較適合于污泥對(duì)染料廢水的脫色。Tripathi等[46]在研究微藻對(duì)重金屬的生物監(jiān)控作用時(shí)指出，連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)和半連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)均接近于天然湖泊的環(huán)境，但連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)需要有精密的設(shè)備且操作繁瑣，因此半連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)更適用于微藻對(duì)重金屬敏感度的研究。

3 半連續(xù)發(fā)酵的類型

3.1 單級(jí)半連續(xù)發(fā)酵

單級(jí)半連續(xù)發(fā)酵具有操作簡(jiǎn)單和應(yīng)用普遍的特點(diǎn)，但是它無(wú)法充分利用底物和菌體。Macias等[47]在醋酸的單級(jí)半連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中，采用計(jì)算機(jī)模擬的方法，對(duì)不同的補(bǔ)料放料策略進(jìn)行比較。研究結(jié)果表明對(duì)于高濃度醋酸的生產(chǎn)，在產(chǎn)物濃度達(dá)到指定值時(shí)補(bǔ)料放料更合適；其他情況下，在指定的時(shí)間下補(bǔ)料放料更合適。3.2 多級(jí)半連續(xù)發(fā)酵

鑒于單級(jí)半連續(xù)發(fā)酵往往無(wú)法充分利用底物和菌體，許多學(xué)者[48-50]嘗試構(gòu)建多級(jí)反應(yīng)系統(tǒng)來(lái)提高底物的利用率和避免代謝產(chǎn)物或代謝副產(chǎn)物在后期影響菌體的活性。為了避免發(fā)酵后期菌體大量死亡并盡可能縮短發(fā)酵周期，董晉軍等[48]采用了兩級(jí)半連續(xù)發(fā)酵工藝進(jìn)行琥珀酸的生產(chǎn)，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到2.38g/(Lgh)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵的生產(chǎn)強(qiáng)度1.13、1.36g/(Lgh)，取得了較好的效果。在兩級(jí)半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)二羥基丙酮的過(guò)程中，Bauer等[50]采用熒光原位雜交技術(shù)，研究了高濃度產(chǎn)物對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用，并據(jù)此確定了兩級(jí)半連續(xù)發(fā)酵工藝中一級(jí)罐的補(bǔ)料放料時(shí)機(jī)(二羥基丙酮質(zhì)量濃度達(dá)到82g/L)，建立了一種比較穩(wěn)定高效的二羥基丙酮生產(chǎn)方法。

4 半連續(xù)發(fā)酵與連續(xù)發(fā)酵的聯(lián)系

相對(duì)于分批發(fā)酵而言，半連續(xù)發(fā)酵與連續(xù)發(fā)酵都要通過(guò)放出一部分發(fā)酵液并補(bǔ)入一部分新鮮培養(yǎng)基的方式，使產(chǎn)物生成期均得到了延長(zhǎng)；但補(bǔ)料和放料方式的不同，又導(dǎo)致了半連續(xù)發(fā)酵工藝與連續(xù)發(fā)酵工藝之間也存在一系列的差異。

Pirt[44]認(rèn)為如果以流加的方式進(jìn)行反復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵，使整個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)達(dá)到擬穩(wěn)態(tài)(比生長(zhǎng)速率≈稀釋率)，那么培養(yǎng)液的體積、稀釋率以及相關(guān)的參數(shù)都會(huì)出現(xiàn)周期性的變化。當(dāng)反復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵的周期趨近于無(wú)窮大、放料體積趨近于無(wú)窮小時(shí)，可以獲得近似恒化培養(yǎng)的穩(wěn)態(tài)，獲得的產(chǎn)物濃度趨近但不超過(guò)恒化培養(yǎng)得到的濃度。由于恒化培養(yǎng)對(duì)化學(xué)環(huán)境要求嚴(yán)格，因此反復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵在技術(shù)上更容易實(shí)現(xiàn)。

Fencl等[51]在培養(yǎng)產(chǎn)蛋白圓酵母菌體時(shí)，對(duì)半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)這兩種操作方式進(jìn)行了比較。認(rèn)為菌體的比生長(zhǎng)速率越低，二者的區(qū)別會(huì)越小，如果半連續(xù)培養(yǎng)的補(bǔ)料的間隔時(shí)間非常短(例如幾分鐘)，而菌體的世代時(shí)間比較長(zhǎng)(例如1h以上)，可以認(rèn)為這兩種操作方式幾乎等同。假如兩種工藝條件下酵母細(xì)胞的世代時(shí)間相同，則連續(xù)培養(yǎng)的稀釋率將比半連續(xù)培養(yǎng)高10%～15%，因此也就更具有優(yōu)勢(shì)。除此之外，半連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中限制性底物濃度的波動(dòng)對(duì)酵母菌體細(xì)胞的生理狀態(tài)會(huì)產(chǎn)生不利影響。

5 半連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中菌體的重復(fù)利用

在半連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中，為了提高生產(chǎn)效率，可以反復(fù)利用有活力的菌體。反復(fù)利用菌體主要通過(guò)離心、膜分離和固定化細(xì)胞3種方式實(shí)現(xiàn)。

5.1 離心

離心是將菌體從發(fā)酵液中分離出來(lái)的一種常用方法。劉永強(qiáng)等[52]采用離心的方法，進(jìn)行了酵母反復(fù)分批發(fā)酵生產(chǎn)甘油的研究。在12個(gè)批次的實(shí)驗(yàn)中，甘油的產(chǎn)量比較穩(wěn)定。但Gledhill等[53]采用離心的方法進(jìn)行溶脂念珠菌半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)強(qiáng)度隨著發(fā)酵周期增多而逐漸降低，可能是由于菌體在離心過(guò)程和再懸浮過(guò)程中受到了傷害，從而導(dǎo)致其活性降低。

5.2 膜分離技術(shù)

利用膜技術(shù)回收菌體的研究由來(lái)已久。從理論上來(lái)說(shuō)，根據(jù)菌體細(xì)胞大小、保持活性條件以及物料理化特性，可選擇適合于回收微生物細(xì)胞的膜，在優(yōu)化膜過(guò)程操作參數(shù)的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)特定的目標(biāo)[54]。一般認(rèn)為，膜生物反應(yīng)器的應(yīng)用能夠使發(fā)酵過(guò)程實(shí)現(xiàn)高菌體濃度和高生產(chǎn)效率[55]。因此，在一些微生物代謝產(chǎn)物如醋酸[56]、乳酸[57]和甘露醇[58]的半連續(xù)發(fā)酵研究中，利用了膜生物反應(yīng)器。

大多數(shù)有機(jī)酸發(fā)酵的細(xì)胞循環(huán)利用都是通過(guò)超濾膜組件來(lái)實(shí)現(xiàn)的，由于膜的孔徑較小和分離過(guò)程中的壓力較高，很容易造成膜的污染并使菌體細(xì)胞受到傷害。因此，在允許的條件下，應(yīng)盡量采用微濾膜組件以提高分離效果并降低分離過(guò)程對(duì)菌體的傷害[59]。利用膜生物反應(yīng)器半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)甘露醇的過(guò)程中，整個(gè)運(yùn)行設(shè)備的死體積(或稱空隙體積)和操作技術(shù)上的偏差可能導(dǎo)致生產(chǎn)強(qiáng)度降低，因此合理的過(guò)程設(shè)計(jì)和恰當(dāng)?shù)倪^(guò)濾時(shí)間至關(guān)重要[58]。近年來(lái)，利用新材料改善膜組件過(guò)濾效果已成為膜生物反應(yīng)器領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[60-61]。

對(duì)于膜生物反應(yīng)器來(lái)說(shuō)，良好的密閉性是避免發(fā)酵污染的基礎(chǔ)[59]。除此之外，選擇合適的膜組件也是至關(guān)重要的。在利用膜反應(yīng)系統(tǒng)連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的過(guò)程中，采用中空纖維膜組件無(wú)法避免雜菌的污染[62]。為了防止染菌，有必要采用能夠耐受高溫滅菌的膜組件(如陶瓷膜組件)以保證嚴(yán)格的無(wú)菌條件。

5.3 固定化細(xì)胞技術(shù)

菌體的重復(fù)利用還可以通過(guò)細(xì)胞的固定化來(lái)實(shí)現(xiàn)。利用固定化細(xì)胞進(jìn)行紅色素的半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)，不僅可以使細(xì)胞生長(zhǎng)維持在最低限度，同時(shí)可以使細(xì)胞內(nèi)的酶活力得到最大限度的保護(hù)，從而達(dá)到了較高的生產(chǎn)強(qiáng)度[63]。但是，固定化細(xì)胞技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用仍存在一定的問(wèn)題。在流化床反應(yīng)器內(nèi)利用多孔玻璃固定的吉利蒙假絲酵母進(jìn)行木糖醇的半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，其發(fā)酵過(guò)程中菌體濃度的不斷增大和各種物質(zhì)轉(zhuǎn)移的障礙使比產(chǎn)物生成速率明顯下降[64]；在固定化酪丁酸梭菌連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的過(guò)程中，后期產(chǎn)物濃度大幅下降可能是由固定化細(xì)胞的堵塞所引起的[65]。要解決這些問(wèn)題，需要從細(xì)胞固定化的載體材料、細(xì)胞的生理性狀、生產(chǎn)工藝等多個(gè)方面進(jìn)行考慮[66-67]。

6 結(jié) 語(yǔ)

半連續(xù)發(fā)酵是一種重要的生化培養(yǎng)方式，在工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究中正逐步得到廣泛應(yīng)用。半連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中，合理控制微生物代謝反應(yīng)途徑是最大程度合成目的產(chǎn)物的前提條件，補(bǔ)料與放料策略的優(yōu)化是提高產(chǎn)量的關(guān)鍵手段，菌體的重復(fù)利用是提升清潔生產(chǎn)水平的重要環(huán)節(jié)。

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Recent Progress in Semi-continuous Fermentation and Its Application

SUN Wen-jing1,2，LIU Chang-feng1,2，ZHOU Yan-zheng2,3，WANG Da-ming4，CUI Feng-jie1,2，YU Lin1,2
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；2. Jiangxi Provincial Engineering and Technology Center for Food Additives Bio-production, Dexing 334221, China；3. Parchn Sodium Isovitamin C Co. Ltd., Dexing 334221, China；4. College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016, China)

Semi-continuous fermentation technology is a typical operational model. In this article, we fi rst introduced the application areas of semi-continuous fermentation, and then reviewed the classification and features of semi-continuous fermentation, its relation to continuous fermentation, and the cell recycling methods during cultivation. Finally, the prospects of semi-continuous fermentation technology were also discussed according to the recent progress on metabolic engineering and process optimization.

semi-continuous fermentation；research progress；application area；prospects

TQ920.62

A

1002-6630(2013)01-0345-06

2011-11-03

江西省科技條件平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目(2010DTZ01900)；江西省創(chuàng)新能力建設(shè)項(xiàng)目(贛發(fā)改高技字[2012]361號(hào))；江西省優(yōu)勢(shì)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目(贛科發(fā)計(jì)字[2010]156號(hào))；江西省主要學(xué)科學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(2008DD00600)；江蘇大學(xué)科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(08JDG029)

孫文敬(1964ü)，男，研究員，博士，研究方向?yàn)樯锘?。E-mail：sunwenjing1919@163.com