張 鑫，馬麗蘋，張 蕓，高 遠，胡 冰，曾曉雄,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471003)

茶是全世界最受歡迎的飲料之一。除了膾炙人口的色、香、味之外，飲茶可以有效的降低罹患各種疾病的風(fēng)險，例如癌癥、高血壓、高血脂等，而研究發(fā)現(xiàn)茶的風(fēng)味與保健功能正是茶葉所特有的茶多酚、茶氨酸等具有生物活性的成分所賦予的[1-3]。近年來，醫(yī)藥、健康研究領(lǐng)域開始越來越關(guān)注茶葉兒茶素體內(nèi)代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與生理活性，綜合目前已有的研究報道來看，茶葉兒茶素在體內(nèi)的代謝主要分為兩大部分，一是通過小腸壁吸收到人體內(nèi)循環(huán)的兒茶素的生物轉(zhuǎn)化，主要包括甲基化、糖基化和硫酸化；二是腸道中微生物對茶葉兒茶素的分解、代謝[4-5]。由于茶葉兒茶素的生物利用率低，直接被小腸吸收的茶葉兒茶素只占人體攝入的茶葉兒茶素的少部分，可以推測人體攝入的茶葉兒茶素絕大部分進入了大腸，并被腸道微生物分解、代謝，發(fā)揮生理作用[6-8]。據(jù)報道[9]富含多酚的藍莓水提取物在體內(nèi)可以發(fā)揮類似于益生元的作用，然而有關(guān)茶葉兒茶素對于腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)作用，目前還鮮有報道。近年來，本課題組建立了茶葉兒茶素包括有抗過敏活性的甲基化兒茶素[10-13]的分離、純化以及高效液相色譜(HPLC)分析方法[14-15]，利用體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)與熒光原位雜交(FISH)技術(shù)分析鷹嘴豆α-低聚半乳糖對腸道菌群的影響[16]。因此，本研究擬利用體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)方式對分離純化得到的茶葉兒茶素、甲基化兒茶素進行發(fā)酵培養(yǎng)，通過FISH方法分析厭氧發(fā)酵過程中有益菌群(雙歧桿菌、乳酸菌)、有害菌群(擬桿菌、梭狀菌)以及總菌群的數(shù)量變化，研究其對于調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的作用，為茶葉兒茶素與甲基化兒茶素生理功能的闡明及其綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏龍茶購自廣東廣州市商場。

Toyopearl HW-40S 日本Tosoh公司；EGCG、ECG、EGC、EC標(biāo)準(zhǔn)品 日本Funakoshi公司；無水乙醇及甲醇 上海國藥化學(xué)試劑有限公司；厭氧混合氣體(10% H2、10% CO2和80% N2)和高純N2南京特種氣體廠；4,6-聯(lián)瞇-2-苯基吲哚二鹽酸(DAPI)熒光染料 德國Roche公司。

表1所示的FISH專用16S rRNA寡合苷酸單鏈探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列5’端所接熒光基團為吲哚二羧菁(Cy3)，使用的探針是前人報道的文獻[14-17]中已經(jīng)成功使用、成熟的探針序列；(－)-表沒食子兒茶素3-O-(3-O-甲基)沒食子酸酯(EGCG3’’Me)及(－)-3-O-甲基-表兒茶素沒食子酸酯(ECG3’Me)標(biāo)樣根據(jù)周蓓等[18]報道的方法制備。

表 1 16S rRNA探針的靶細菌種/屬和探針序列Table 1 Sequences, target genera or species of 16S rRNA-based probes

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100高效液相色譜儀(包括G1328B手動進樣器、G1311A四元泵、G1379A真空脫氣機、G1316A柱溫箱和G1315B二極管陣列檢測器(DAD)) 美國安捷倫公司；中壓色譜儀 瑞士Büchi公司；Laborota 4000真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；冷凍干燥機 英國Labconco公司；AY-120電子精密天平、BL-220H分析天平 日本Shimadzu公司；YQX-I厭氧培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；Zeiss Axio Imager A1型熒光正置顯微鏡系統(tǒng) 德國Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 茶葉兒茶素樣品的制備

稱取適量的粉碎茶樣，按照料液比1：20(m/V)加入熱水，在90℃恒溫振蕩器中振蕩提取40min，室溫條件下4500×g離心15min得上清液，茶渣用同樣方法再次浸提，合并兩次上清液并濃縮、凍干，得到茶多酚粗提物。

將茶多酚粗提物制成一定質(zhì)量濃度的料液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后上聚酰胺層析柱(1.6cm×30cm)。首先用水洗去水溶性雜質(zhì)，洗脫2BV(BV為柱床體積)后換用95%的乙醇洗脫，收集2BV洗脫液，濃縮，上Toyopearl HW-40S柱(5.0cm×50cm)，用70%～90%的乙醇洗脫，采用自動部分收集器收集洗脫液(10mL/管)，并利用HPLC分析洗脫液中兒茶素的組成，合并合適的組分，濃縮、凍干，得到各茶葉兒茶素樣品。

1.3.2 茶葉兒茶素含量的測定

采用HPLC外標(biāo)法測定分離純化得到的兒茶素樣品的純度[19]。色譜條件：TSKgel ODS-100Z色譜柱(4.6mm× 150mm，5μm)，柱溫40℃，檢測波長280nm；梯度洗脫(流動相A：CH3COOH，pH 2.5；流動相B：CH3OH)，洗脫時間15min，流動相A體積分?jǐn)?shù)由82%降至40%，流動相B體積分?jǐn)?shù)由18%升至60%，流速1.0mL/min；進樣量20μL。

兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精確稱取各茶葉兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于水中，配制成一系列不同質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.45μm針頭式濾膜過濾后，按質(zhì)量濃度從低到高的順序進行HPLC檢測，記錄各個質(zhì)量濃度對應(yīng)的峰面積并以峰面積對質(zhì)量濃度作圖，得到各種兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)

糞便樣本的收集與處理：收集受試者(受試者為3人，均為25～30歲之間健康人群，且在近2個月內(nèi)未服用過抗生素)的新鮮全便，置于一次性硬質(zhì)無菌塑料袋中，封口后盡快存放于4℃冰箱。使用時混勻并稱取0.5g，加入4.5mL經(jīng)過濾、脫氧處理的PBS緩沖液，迅速置于厭氧培養(yǎng)箱中，經(jīng)旋渦混合器振蕩混勻3min，待用。體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)按照Manz等[16]報道的方法進行。首先稱取受試的茶葉兒茶素樣品溶解于高壓滅菌后的含氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基：1L超純水含有蛋白胨2g、酵母膏2g、NaCl 0.1g、K2HPO40.04g、MgSO4·7H2O 0.01g、CaCl2·7H2O 0.01g、NaHCO32g、氯化血紅素0.05g、L-半胱氨酸0.5g、膽汁酸鹽0.5g、吐溫-80 2mL、VK 10μL；0.025g/100mL刃天青4mL)中，得到終質(zhì)量濃度為1g/1000mL的底物溶液。然后取糞便樣液(10%、pH 7.3的PBS)150μL懸浮于1.35mL含有各種茶葉兒茶素樣品的底物培養(yǎng)基溶液中，混合均勻后放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱(10% H2、10% CO2、80% N2)中，37℃發(fā)酵培養(yǎng)。在培養(yǎng)時間為0、6、12、24h時分別取100μL樣液，供細胞FISH計數(shù)。實驗設(shè)3個重復(fù)，對照為不加任何茶葉兒茶素的處理。

1.3.4 菌體計數(shù)

菌體計數(shù)采用FISH法[15-17,20]。將300μL的多聚甲醛(pH7.2、4g/100mL)加入到100μL體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)發(fā)酵樣液中，置于4℃冰箱中冷藏16h，離心后用PBS緩沖液沖洗兩次，再用300μL PBS-酒精(體積比1：1)保存菌體。取菌體樣液10μL，滴入經(jīng)過鉻明膠溶液包埋過的載玻片圓孔內(nèi)，平鋪于整個圓圈，在陰暗處自然風(fēng)干3h，然后用50%、80%、96%的乙醇溶液進行連續(xù)脫水操作(各3min)，自然風(fēng)干。將1μL 50ng/μL的探針試劑與9μL雜交緩沖液加到載玻片的菌體試樣中，然后迅速將載玻片置入含有雜交緩沖液的濕盒中，根據(jù)探針類型采用不同溫度條件(探針Bif164：50℃，探針Lab158：45℃，探針Bac303：45℃，探針His150：50℃)雜交10h。雜交結(jié)束后，迅速用清洗緩沖液與超純水沖洗載玻片，在避光條件下自然風(fēng)干。測定總菌體數(shù)時，將10μL 1.25ng/μL的DAPI溶液加入到雜交后的載玻片上，保持5min，然后用超純水沖洗與自然干燥。所有樣品用Zeiss Axio Imager A1型熒光正置顯微鏡系統(tǒng)進行觀測，采用AxioVision熒光成像軟件對每個試樣隨機選擇10～15個視野進行拍照，記錄熒光光點。在對雜交后的各種菌體進行拍照與熒光光點計數(shù)后，根據(jù)試樣質(zhì)量濃度以及稀釋倍數(shù)等計算出細菌總數(shù)，并取其以對數(shù)(lg(細菌總數(shù)/mL))。

1.3.5 益生指數(shù)(PI)的計算

參考Palframan等[21]的方法計算PI。

PI = (Bif/Total)+(Lac/Total)－(Bac/Total)－(His/Total)

式中：Bif代表不同時間點Bifidobacterium spp.的數(shù)量除以接種時的數(shù)量；Lac代表不同時間點Lactobacillus-Enterococcus spp.的數(shù)量除以接種時的數(shù)量；Bac代表不同時間點Bacteroides-Prevotella group的數(shù)量除以接種時的數(shù)量；His代表不同時間點Clostridium histolyticum group的數(shù)量除以接種時的數(shù)量；Total代表不同時間點總菌群的數(shù)量除以接種時的數(shù)量。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉兒茶素樣品的制備

富含甲基化兒茶素的茶葉經(jīng)熱水浸提、濃縮和凍干，得到茶多酚粗提物。由于茶多酚粗提物含有一定量的多糖、咖啡堿等雜質(zhì)，因此采用聚酰胺樹脂層析柱對其進行分離純化。經(jīng)過聚酰胺樹脂柱層析分離之后，茶多酚含量提高到90%。由于Toyopearl HW-40S對于從茶多酚中分離茶葉兒茶素單體有著很好的效果[18]，所以本實驗將初步純化的茶多酚上Toyopearl HW-40S層析柱，進行高純度EGCG和EGCG3”Me的樣品制備。通過70%～90%的乙醇洗脫，分別制備得到了純度30% EGCG3”Me的樣品、50% EGCG3’’Me的樣品、90% EGCG3”Me的樣品和90% EGCG的樣品。圖1為EGCG與EGCG3”Me的結(jié)構(gòu)圖。

圖 1 EGCG和EGCG3”Me的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of EGCG and EGCG3” Me

2.2 茶葉兒茶素對腸道中有益菌群(雙歧桿菌和乳酸菌)的增殖作用

圖 2 EGCG和EGCG3”Me體外厭氧發(fā)酵樣液FISH處理后熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果Fig.2 FISH results of anaerobic fermentation broth with EGCG and EGCG3”Me observed under epifluorescence microscope

圖2A和圖2B分別為使用Bif164探針和Lab158探針對于茶葉兒茶素樣品經(jīng)厭氧發(fā)酵的樣液，經(jīng)FISH處理后熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果。表2為以不同茶葉兒茶素樣品為底物時，不同發(fā)酵時間有益菌群(雙歧桿菌和乳酸菌)的增殖情況?？梢钥闯觯诓煌陌l(fā)酵時間點，與對照組相比EGCG和EGCG3’’Me樣品都可以更好的促進雙歧桿菌的增長，說明茶葉兒茶素對于雙歧桿菌的增殖作用明顯。隨著發(fā)酵時間的延長，雙歧桿菌的數(shù)量逐漸增多，發(fā)酵時間為6h與24h時各茶葉兒茶素樣品的差異顯著。當(dāng)培養(yǎng)時間達到24h時，純度為90%的EGCG3’’Me的效果好于同樣純度的EGCG，同時也高于相對較低純度的EGCG3’’Me樣品，它們之間的差異顯著。

表 2 EGCG3’’Me和EGCG體外厭氧發(fā)酵0、6、12、24h后雙歧桿菌和乳酸菌的數(shù)量Table 2 Number of Bifidobacterium spp. and Lactobacillus/Enterococcus spp. in anaerobic fermentation broth of EGCG3”Me and EGCG at 0, 6, 12 h and 24 h lg(細菌總數(shù)/mL)

由表2可知，與對照組相比，在不同的發(fā)酵時間點不同茶葉兒茶素樣品對乳酸菌的增殖作用也呈現(xiàn)差異性，說明茶葉兒茶素對于乳酸菌有著較好的增殖效果。隨著發(fā)酵時間的延長，乳酸菌的數(shù)量逐漸增多，發(fā)酵時間為6h與24h時各茶葉兒茶素樣品的增殖效果差異顯著。當(dāng)培養(yǎng)時間為24h時，純度為90%的EGCG與純度分別為30%和50%的EGCG3”Me對于乳酸菌的增殖作用差異不顯著，而純度為90%的EGCG3”Me與其他樣品相比差異顯著，可以明顯的促進乳酸菌的增殖。

2.3 茶葉兒茶素對腸道中有害菌群(擬桿菌和梭狀菌)的增殖作用

圖2C和圖2D分別為使用Bac303和His150探針對于不同茶葉兒茶素樣品經(jīng)厭氧發(fā)酵的樣液，經(jīng)FISH處理后熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果，表3為以不同茶葉兒茶素樣品為底物時，不同發(fā)酵時間擬桿菌和梭狀菌的增殖情況。由表中可以看出，若樣品中不加任何茶葉兒茶素，隨著發(fā)酵時間的延長，擬桿菌的數(shù)量逐漸增多。與對照組相比，在不同的發(fā)酵時間點，不同茶葉兒茶素樣品對擬桿菌增殖的抑制作用差異顯著。隨著發(fā)酵時間的延長，擬桿菌的數(shù)量逐漸減少，發(fā)酵時間為6h與24h的各兒茶素樣品具有差異顯著性，說明兒茶素樣品對于擬桿菌的抑制作用明顯。當(dāng)培養(yǎng)時間達到24h時，純度50%和90%的EGCG3”Me樣品差異不顯著，而純度為90%的EGCG3”Me與同樣純度的EGCG差異也不顯著。

由表3可知，與對照組相比，在不同的發(fā)酵時間點不同茶葉兒茶素樣品對梭狀菌增殖的抑制作用具有顯著差異。隨著發(fā)酵時間的延長，梭狀菌的數(shù)量逐漸減少，發(fā)酵時間為6h與24h的各茶葉兒茶素樣品的抑制效果具有差異顯著性?？梢钥闯觯珽GCG和EGCG3’’Me都可以達到抑制梭狀菌增殖的效果，當(dāng)培養(yǎng)時間達到24h時，純度50%和90%的EGCG3’Me樣品的效果差異不顯著，而純度為90%的EGCG3’’Me樣品的效果好于同樣純度的EGCG樣品的效果。

表 3 EGCG3”Me和EGCG體外厭氧發(fā)酵0、6、12、24 h后擬桿菌和梭狀菌的數(shù)量Table 3 Number of Bacteroids-Prevotella spp. and Clostridium histolyticum in anaerobic fermentation broth of EGCG3”Me and EGCG at 0, 6, 12 h and 24 h lg(細菌總數(shù)/mL)

2.4 茶葉兒茶素對腸道總菌群數(shù)的影響

表 4 EGCG3”Me和EGCG體外厭氧發(fā)酵0、6、12、24 h后總菌群的數(shù)量Table 4 Number of total bacteria in anaerobic fermentation broth of EGCG3”Me and EGCG at 0, 6, 12 h and 24 h lg(細菌總數(shù)/mL)

圖2E為使用DAPI熒光染料對不同兒茶素樣品經(jīng)厭氧發(fā)酵的樣液，經(jīng)FISH處理后熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果。由表4可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，腸道內(nèi)菌群的數(shù)量在慢慢增多，12h與6h具有差異顯著性，而24h時不同純度的茶葉兒茶素樣品與對照組相比對腸道內(nèi)總菌群的影響不顯著，說明EGCG與EGCG3’’Me基本不會影響腸道內(nèi)總菌群的數(shù)量。結(jié)合前面的實驗數(shù)據(jù)可以得出，茶葉兒茶素只是改變了腸道內(nèi)菌體的組成，對總體菌群的數(shù)量基本沒有影響。

2.5 益生指數(shù)(PI)的比較

由圖3可知，EGCG3’’Me的純度越高的樣品，其PI值越大，EGCG含量為90%的樣品和EGCG3’’Me含量為90%、50%、30%的樣品的PI值分別為1.86(24h)、2.68(6h)、2.25(6h)和2.14(6h)，而對照組為0.12(12h)。在不同發(fā)酵時間點，各茶葉兒茶素樣品與對照組相比，PI值都具有顯著差異性(P＜0.05)；除了純度為30%的EGCG3’’Me在12h和24h的PI值差異不顯著(P＞0.05)外，各茶葉兒茶素樣品之間的PI值在各發(fā)酵時間點其差異顯著(P＜0.05)。對于不同純度的EGCG3’’Me樣品，其PI值在厭氧發(fā)酵6h時最大，而后降低，可能是由于一開始菌體的大量增殖使得體系中的營養(yǎng)物質(zhì)被大量利用，后因營養(yǎng)的缺乏導(dǎo)致部分菌體死亡，而純度為90%的EGCG樣品，隨著發(fā)酵時間的延長，其PI值逐漸增大。結(jié)合前面的分析可以得出，對照組對有害菌的增殖大于有益菌，而不同純度的茶葉兒茶素樣品對有益菌有較好的增殖作用，對有害菌有較好的抑制作用。在不同的厭氧發(fā)酵時間點，各種純度的EGCG3’’Me樣品的PI值都大于純度為90%的EGCG；隨著純度的升高，EGCG3’’Me樣品的PI值也在增加，且差異顯著。

圖 3 體外厭氧發(fā)酵6、12、24h時茶葉兒茶素的益生指數(shù)Fig.3 Probiotic index (PI) of anaerobic fermentation broth of tea catechins at 6, 12 h and 24 h

Molan等[9]報道藍莓多酚提取物能促進雙歧桿菌和乳酸菌在腸道內(nèi)的定殖，從而競爭性的抑制病原菌在腸道內(nèi)的黏附、定殖和繁殖。一般而言，腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸菌等有益菌數(shù)量的增加可以更加有效的減少氨、糞臭素及前致癌物質(zhì)的形成，增加有機酸的產(chǎn)生，降低結(jié)腸及糞便的pH值，抑制病原菌的生長繁殖，從而改善腸道的微環(huán)境，促進人體的健康[22-24]。研究發(fā)現(xiàn)茶葉兒茶素能有效促進有益菌的增長，同時抑制病原菌的增殖，因此茶葉兒茶素類物質(zhì)，尤其是甲基化兒茶素，在腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)方面起到積極的作用。茶葉兒茶素發(fā)揮益生元功能，可能的機理是茶葉兒茶素作為抗氧化劑可以調(diào)節(jié)代謝活動中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，從而為腸道中有益菌生長和繁殖提供更有利的環(huán)境[25-26]。同時，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的短鏈脂肪酸能夠降低腸道的pH值，有效調(diào)節(jié)腸道的微生態(tài)環(huán)境，在促進有益菌生長的同時，抑制有害菌的繁殖[27]。

3 結(jié) 論

本研究以中國烏龍茶為原料，制備得到了高純度EGCG及不同純度的EGCG3’’Me樣品。體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)實驗結(jié)果表明，茶葉兒茶素樣品對雙歧桿菌、乳酸菌都有較好的增殖作用，并對擬桿菌、梭狀菌的生長有一定的抑制作用。甲基化兒茶素對腸道菌群的影響只是改變了腸道內(nèi)菌體的組成，對總體菌群的數(shù)量基本沒有影響；90% EGCG3’’Me的樣品對有益菌的增殖作用最強，對有害菌的抑制作用也最強，且具有最高的PI值(2.68)。因此茶葉兒茶素特別是甲基化兒茶素對于腸道的微生態(tài)調(diào)節(jié)作用，為茶葉兒茶素的作用機理研究及其開發(fā)利用提供參考。

[1] 毛清黎, 施兆鵬, 李玲, 等. 茶葉兒茶素保健及藥理功能研究新進展[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(8)： 584-589.

[2] KHAN N, MUKHTAR H. Tea polyphenols for health promotion[J]. Life Science, 2007, 81： 519-533.

[3] 王開榮, 邵淑宏, 葉儉慧, 等. 茶氨酸保健功能研究進展[J]. 茶葉, 35(3)： 140-144.

[4] LAMBERT J D, SANG S, YANG C S. Biotransformation of green tea polyphenols and the biological activities of those metabolites[J]. Molecular Pharmaceutics, 2007, 4(6)： 819-825.

[5] LEE H C, JENNER A M, LOW C S, et al. Effect of tea phenolics and their aromatic fecal bacterial metabolites on intestinal microbiota[J]. Research in Microbiology, 2006, 157： 876-884.

[6] LEE M J, MALIAKAL P, CHEN L S. Pharmacokinetics of tea catechins after ingestion of green tea and (－)-epigallocatechin-3-gallate by humans formation of different metabolites and individual variability[J]. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention, 2002, 11： 1025-1032.

[7] BEVERLY A W, LAMETTA S S, GARY R B, et al. Catechins are bioavailable in men and women drinking black tea throughout the day[J]. Journal of Nutrition, 2001, 131： 1731-1737.

[8] MENG Xiaofeng, SANG Shengmin, ZHU Nanqun, et al. Identification and characterization of methylated and ring-fission metabolites of tea catechins formed in humans, mice and rats[J]. Chemical Research in Toxicology, 2002, 15(8)： 1042-1050.

[9] MOLAN A L, LILA M A, MAWSON J, et al. in vitro and in vivo evaluation of the prebiotic activity of water-soluble blueberry extracts[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2009, 25： 1243-1249.

[10] 呂海鵬, 林智, 譚俊峰, 等. 茶葉中的EGCG3”Me研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2008, 34(10)： 22-25.

[11] 孫業(yè)良, 呂海鵬, 林智, 等. 茶葉中EGCG3”Me的分析方法研究[J]. 茶葉科學(xué), 2009, 29(5)： 379-384.

[12] 伍妍俊, 汪小鋼, 宛曉春. 甲基化EGCG的研究現(xiàn)狀及展望[J]. 茶葉科學(xué), 2010, 30(6)： 407-413.

[13] 李銀花, 李娟, 龔雪, 等. 茶葉中甲基化EGCG的研究進展[J]. 中國茶葉, 2010(8)： 12-13.

[14] WILKINSON H, WELLING G W. Quantitative fluorescence in situ hybridization of Bifi dobacterium spp. with genus-specific 16S rRNAtargeted probes and its application in fecal samples[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61： 3069-3075.

[15] HARMSEN H J M, ELFFERICH P, SCHUT F, et al. A 16S rRNAtargeted probe for detection of lactobacilli and enterococci in fecal samples by fluorescent in situ hybridization[J]. Microbial Ecology in Health and Disease, 1999, 11： 3-12.

[16] MANZ W, AMANN R, LUDWIG W, et al. Application of a suite of 16S rRNA-specific oligonucleotide probes designed to investigate bacteria of the phylum Cytophaga-Flavobacter-Bacteroides in the natural environment[J]. Microbiology, 1996, 142： 1097-1106.

[17] FRANKS A H, HARMSEN H J, RAANGS G C, et al. Variations of bacterial populations in human feces measured by fluorescent in situ hybridization with group-specific 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 9： 3336-3345.

[18] 周蓓, 王琳, 李偉, 等. 茶葉中甲基化兒茶素的分離、純化和高效液相色譜法分析[J]. 分析化學(xué), 2008, 36(4)： 494-498.

[19] HU Bing, WANG Lin, ZHOU Bei, et al. Efficient procedure for isolating methylated catechins from green tea and effective simultaneous analysis of ten catechins, three purine alkaloids, and gallic acid in tea by high-performance liquid chromatography with diode array detection[J]. Journal of Chromatography A, 2009, 1216： 3223-3231.

[20] 賀晉艷, 張蕓, 李偉, 等. 鷹嘴豆α-低聚半乳糖的腸道益生功能[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(15)： 94-95.

[21] PALFRAMAN R, GIBSON G R, RASTALL R A. Development of a quantitative tool for the comparison of the prebiotic effect of dietary oligosaccharides[J]. Letters in Applied Microbiology, 2003, 37： 281-284.

[22] LAPARRA J M, SANZ Y. Interactions of gut microbiota with functional food components and nutraceuticals[J]. Pharmacological Research, 2010, 61： 219-225.

[23] BURNS A J, ROWLAND I R. Anti-carcinogenicity of probiotics and prebiotics[J]. Current Issues in Intestinal Microbiology, 2000, 1： 13-24.

[24] BIALONSKA D, RAMNANI P, KASIMETTY S G, et al. The influence of pomegranate by-product and punicalagins on selected groups of human intestinal microbiota[J]. International Journal of Food Microbiology, 2010, 140： 175-182.

[25] KAHKONEN M P, HOPIA A I, HEINONEN M. Berry phenolics and their antioxidant activity[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49： 4076-4082.

[26] SCHOTSMANS W, MOLAN A L, MACKAY B. Controlled atmosphere storage of rabbiteye blueberries enhances postharvest quality aspects[J]. Postharvest Biology and Technology, 2007, 44： 277-285.

[27] BURNS A J, ROWLAND I R. Anti-carcinogenicity of probiotics and prebiotics[J]. Current Issues in Intestinal Microbiology, 2000, 1： 13-24.