樊 迎，王常青*，王 菲，于書佳，連偉帥，原 敏

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006)

黑豆(Glycine soja Sieb.et Zucc)異名烏豆、冬豆子，系豆科植物大豆的干燥種子，按其顆粒大小可分為大黑豆和小黑豆兩種，小黑豆的主要產(chǎn)區(qū)在山西、陜西、寧夏等省份及黃土高原地區(qū)[1]。其蛋白質(zhì)含量高達(dá)48%以上，居豆類之首。小黑豆乳清蛋白(small black beans whey protein，SBWP)存在于加工黑豆分離蛋白和豆制品過程中排放的廢水中，初步估算，每生產(chǎn)1t的分離蛋白會排放20～30m3的乳清廢水。近年來已有關(guān)于大豆乳清蛋白抗腫瘤和大豆多肽抗疲勞和保肝的報道[2-3]，但是尚未見到SBWP以及小黑豆乳清水解多肽(small black beans whey peptides，SBWPE)抗肝損傷作用的研究。分析表明，本實(shí)驗(yàn)所用的SBWP和SBWPE的氨基酸組成基本符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)頒布的人體氨基酸需求模式[4]。因此，研究小黑豆乳清蛋白和水解多肽的保健功能，不但對減少廢水排放和環(huán)境保護(hù)有實(shí)際意義，而且可以為小黑豆藥物和功能食品的開發(fā)提供依據(jù)。

化學(xué)性肝損傷是由攝入的化學(xué)毒物或藥物在體內(nèi)代謝或轉(zhuǎn)化所導(dǎo)致的肝臟慢性或急性損傷，據(jù)國內(nèi)多家醫(yī)院統(tǒng)計數(shù)據(jù)，每年因肝損傷住院的患者占急性肝炎患者的10%，且呈逐年上升趨勢[5]，因而天然提取物開發(fā)保肝食品和藥品已成為研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型為對象，研究探討SBWP和SBWPE對急性肝損傷的保護(hù)作用，為小黑豆乳清的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用7周齡的昆明種雄性小鼠(SPF級，體質(zhì)量22～25g)，由山西醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。

本研究所用SBWP由本實(shí)驗(yàn)室用堿溶酸沉法提取[6]；經(jīng)檢測，該蛋白的干燥物中粗蛋白含量為47.3%；SBWPE采用537酸性蛋白酶水解SBWP得到，其中分子質(zhì)量在3000u左右的多肽占總肽的85%。

谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、丙二醛(MDA)和甘油三酯(TG)試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16G型臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；TG16A-WS臺式高速離心機(jī) 湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；MR1822高速冷凍離心機(jī) 法國Jouan公司；Lecia RM2255輪轉(zhuǎn)式切片機(jī) 德國Leica儀器公司；體視顯微鏡 上海光學(xué)儀器廠；顯微電子攝像機(jī) 杭州科藝科技公司；Spectramax M5酶標(biāo)儀 天津泰科嘉華金屬貿(mào)易有限公司；Olympus BX51顯微照相儀 日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 動物飼養(yǎng)與模型建立

實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)分為基礎(chǔ)組、模型組及SBWP高、低劑量組和SBWPE高、低劑量組6組?；A(chǔ)組和模型組喂食基礎(chǔ)飼料，其配方為：面粉與麩皮各10%、玉米面34%、高粱面14.5%、豆餅粉20%、植物油1.5%、魚粉5%、骨粉2%、食鹽、干酵母、魚油乳液各1%，VB2加入量為60mg/kg飼料；SBWP與SBWPE高、低劑量組的飼料是在基礎(chǔ)飼料中分別按36g/kg飼料和12g/kg飼料的量加入相應(yīng)受試物，每只動物的日投食量均為5g，若動物體質(zhì)量以30g/只計算，則相當(dāng)于日攝入SBWP與SBWPE 0.18g和0.06g，實(shí)驗(yàn)期為30d。各組動物自由飲水，于實(shí)驗(yàn)第30天，各組動物稱質(zhì)量后禁食16h，模型組和各劑量組動物灌胃5mL/kg的1% CCl4溶液，基礎(chǔ)組灌胃等量的生理鹽水；24h后處死動物，測定各項(xiàng)生化指標(biāo)并進(jìn)行肝臟組織學(xué)與形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.2 血清與肝臟中生化指標(biāo)測定方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，動物摘眼球取血，冷凍離心分離血清，按照試劑盒的要求測定血清AST和ALT的活力單位數(shù)；之后頸椎脫臼處死小鼠，解剖、稱取一定質(zhì)量的肝臟，用4℃的生理鹽水洗去污血和雜物，加入肝臟質(zhì)量10倍體積的生理鹽水，在冰浴中充分研磨成細(xì)漿，再以3000r/min離心取上清液，按照試劑盒的方法測定肝勻漿中MDA含量和TG含量；用Folin-酚法測定肝蛋白含量[7]；用5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(TDNB)法測定肝臟GSH含量[8]。

1.3.3 肝臟形態(tài)學(xué)和組織學(xué)觀察與分析

取新鮮肝臟，在體視顯微鏡下觀察形態(tài)變化，并用100倍電子攝像機(jī)攝像。取小鼠肝左葉相同部位組織，經(jīng)10%福爾馬林固定、石蠟包埋及二甲苯透明后切片，經(jīng)HE染色，光鏡下觀測肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。

1.4 統(tǒng)計分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS18.0軟件處理，組間差異采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)過程中各組動物的體質(zhì)量變化

表 1 實(shí)驗(yàn)動物的體質(zhì)量變化及動態(tài)分析(±s，n=10)Table 1 Body weight change and dynamic analysis of experimental mice (±s，n=10)

表 1 實(shí)驗(yàn)動物的體質(zhì)量變化及動態(tài)分析(±s，n=10)Table 1 Body weight change and dynamic analysis of experimental mice (±s，n=10)

注： *.與基礎(chǔ)組比較，差異顯著(P ＜0.05)；**.與基礎(chǔ)組比較，差異極顯著(P ＜0.01)。

組別 體質(zhì)量/g 0周2周4周基礎(chǔ)組24.69±1.6931.88±1.4835.20±1.10模型組24.27±1.9731.87±2.5835.02±2.32 SBWP高劑量組24.07±0.9722.71±2.51**32.19±2.39**SBWP低劑量組24.91±1.0125.48±1.78**33.21±2.11**SBWPE高劑量組25.3±1.6030.92±1.5234.19±2.79 SBWPE低劑量組24.68±1.1832.35±1.8535.64±2.24

由表1可見，實(shí)驗(yàn)開始時各組動物體質(zhì)量基本相同；實(shí)驗(yàn)第2～4周，SBWP高、低劑量組小鼠與同期基礎(chǔ)組和模型組比，體質(zhì)量偏低，且差異極顯著(P＜0.01)，SBWPE組無體質(zhì)量減輕現(xiàn)象。可能是因?yàn)槿榍宓鞍字械囊鹊鞍酌敢种苿┙档土藙游飳Φ鞍踪|(zhì)的消化和吸收利用所導(dǎo)致[9]。

2.2 SBWP和SBWPE對血清ALT、AST活力的影響

表 2 SBWP與SBWPE對CCl4肝損傷小鼠血清ALT、AST活力單位數(shù)的影響(±s，n=10)Table 2 Effects of SBWP and SBWPE on ALT and AST activities in CCl4-induced liver injury in mice (±s，n=10)

表 2 SBWP與SBWPE對CCl4肝損傷小鼠血清ALT、AST活力單位數(shù)的影響(±s，n=10)Table 2 Effects of SBWP and SBWPE on ALT and AST activities in CCl4-induced liver injury in mice (±s，n=10)

注： *.與模型組比較，差異顯著(P ＜0.05）；**.與模型組比較，差異極顯著(P ＜0.01）。下同。

組別 劑量/(g/(kg·d))AST活力/(U/L)ALT活力/(U/L)基礎(chǔ)組051.83±6.41**45.06±5.88**模型組0100.19±9.05176.19±23.46 SBWP高劑量組696.47±8.51156.14±19.74**SBWP低劑量組298.02±10.73166.62±12.06*SBWPE高劑量組691.73±11.57*160.33±15.49*SBWPE低劑量組290.62±9.65*165.81±16.25*

由表2可知，與基礎(chǔ)組相比，模型組小鼠血清的AST、ALT活力極顯著升高(P＜0.01)，說明肝損傷建模成功。與模型組比較，SBWP和SBWPE的高、低劑量組均可以明顯降低ALT水平(P＜0.05或P＜0.01)；相對于AST來說，SBWPE的高、低劑量組均有顯著降低(P＜0.05)，而SBWP各組均無明顯降低。說明SBWP和SBWPE對CCl4型肝損傷模型小鼠ALT功能的保護(hù)有積極作用，但對于AST的降低作用尚不一致。

2.3 SBWP和SBWPE對小鼠肝臟TG、MDA、GSH含量的影響

表 3 SBWP與SBWPE對CCl4肝損傷小鼠肝臟TG、MDA和GSH含量的影響(±s，n=10)Table 3 Effects of SBWP and SBWPE on TG, MDA and GSH contents in CCl4-induced liver injury mouse liver (±s，n=10)

表 3 SBWP與SBWPE對CCl4肝損傷小鼠肝臟TG、MDA和GSH含量的影響(±s，n=10)Table 3 Effects of SBWP and SBWPE on TG, MDA and GSH contents in CCl4-induced liver injury mouse liver (±s，n=10)

組別 劑量/(g/(kg·d)) TG含量/(mmol/L) MDA含量/(nmol/mg pro) GSH含量/(μmol/g pro)基礎(chǔ)組02.05±0.31**3.02±0.20**6.29±0.80**模型組02.81±0.906.21±0.692.42±0.55 SBWP高劑量組61.30±0.52**4.78±0.44**3.61±0.27**SBWP低劑量組22.66±0.664.85±0.64**2.46±0.63 SBWPE高劑量組61.32±0.58**4.84±0.50**3.73±0.46**SBWPE低劑量組22.48±0.456.09±0.652.53±0.49

由表3可見，小鼠CCl4灌胃24h后，模型組肝TG、MDA的含量較基礎(chǔ)組明顯升高，GSH含量極顯著降低(P＜0.01)，說明急性肝損傷建模成功。SBWP和SBWPE高劑量組的TG、MDA和GSH含量與模型組相比均有極顯著的改善(P＜0.01)，而在低劑量SBWP和SBWPE實(shí)驗(yàn)組中，除SBWP有降低MDA效果外(P＜0.01)，其他各項(xiàng)指標(biāo)與模型組相比均無明顯變化。提示飼料中加入量為36g/kg的小黑豆乳清蛋白和水解多肽能顯著抑制TG和MDA產(chǎn)物的生成，提高抗氧化物質(zhì)GSH的含量；而12g/kg的加入量對降低肝臟TG和提高GSH作用不明顯。

2.4 SBWP和SBWPE對小鼠肝臟形態(tài)學(xué)的影響

2.4.1 肝臟形態(tài)學(xué)觀察

圖 1 CCl4肝損傷小鼠肝臟形態(tài)學(xué)比較 (×100)Fig.1 Morphology of hepatic injury in CCl4-induced mice administered with SBWP and SBWPE at various dosages(×100)

顯微(圖1)觀察可以看到，基礎(chǔ)組肝臟呈暗紅色，肝細(xì)胞表面光滑，質(zhì)地柔軟，無脂肪滴。模型組肝臟表面呈粗糙的沙粒狀，顏色泛白無光澤且有變性脂肪滴溢出，組織很脆且很易出血、邊緣外翻[10]。SBWP高劑量組和SBWPE高劑量組的肝臟與基礎(chǔ)組動物肝臟很相近，表面呈暗紅色；SBWP低劑量組和SBWPE低劑量組的小鼠肝臟顏色也比較暗淡、呈細(xì)小顆粒狀和輕微的變性脂肪滴，與模型組的肝臟形態(tài)相近，但較模型組有改善?？梢钥闯鯯BWP和SBWPE對由CCl4引起的急性肝損傷有明顯的改善作用，且呈一定的量效關(guān)系。

2.4.2 肝組織學(xué)分析

圖 2 小鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化 (×400)Fig.2 Histological changes of liver in mice (×400)

肝組織切片(圖2)可見，基礎(chǔ)組小鼠的肝細(xì)胞大小均勻、整齊，肝小葉輪廓清晰，細(xì)胞分界清，細(xì)胞核圓而清晰，胞質(zhì)豐富，未見細(xì)胞變性和異常。模型組肝細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，正常組織結(jié)構(gòu)明顯消失，小葉界限不清，細(xì)胞索紊亂，大部分肝竇消失，肝細(xì)胞廣泛性水樣變性，核膜皺縮，有破碎的核，可見點(diǎn)狀壞死甚至崩裂[11-12]，可見急性肝損傷建模成功。SBWP和SBWPE高、低劑量組的肝細(xì)胞壞死、氣球樣變、水樣變性和胞漿凝聚等病變情況都較模型組有不同程度減輕，其中以SBWP高劑量組的情況為最好，接近于基礎(chǔ)組?？梢?，SBWP和SBWPE這兩種物質(zhì)及劑量的不同對CCl4急性肝損傷的保護(hù)效果有所不同：SBWP對修復(fù)肝臟組織結(jié)構(gòu)效果比較明顯，SBWPE對于保護(hù)肝細(xì)胞膜以及亞細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)完整效果更明顯，且均是高劑量組的肝細(xì)胞比低劑量組的更接近正常。

3 討 論

用CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷是肝損傷的一種常用模型，用來檢測或研究藥物或其他物質(zhì)對肝損傷的保護(hù)作用。CCl4進(jìn)入體內(nèi)活化生成三氯甲基自由基和過氧自由基,攻擊肝臟細(xì)胞膜上的磷脂分子，使得細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜發(fā)生氯烷化和脂質(zhì)過氧化，因而造成TG含量升高、GSH含量降低、MDA含量升高和代謝紊亂；CCl4代謝產(chǎn)物還會破壞肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，致使ALT、AST滲漏入血、活力升高。而有保肝作用的活性物質(zhì)可以通過抗氧化和清除自由基，使CCl4肝損傷模型動物的生化指標(biāo)和病變肝臟得到糾正[13-14]。從抗氧化指標(biāo)看，無論SBWP還是SBWPE，均為6g/(kg·d)劑量組優(yōu)于2g/(kg·d)劑量組，說明兩者的抗氧化效果在此劑量范圍內(nèi)存在效量關(guān)系；肝組織學(xué)和形態(tài)學(xué)檢測也說明，SBWP和SBWPE高劑量組對CCl4型小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用優(yōu)于低劑量組，其恢復(fù)效果與抗氧化效果基本一致。由此可見，小黑豆乳清蛋白和水解多肽可能是通過抗脂質(zhì)過氧化作用來促進(jìn)肝細(xì)胞的再生和修復(fù)，并體現(xiàn)其保肝作用的[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，SBWP和SBWPE對降低ALT效果顯著，而SBWP對AST的效果不明顯，原因可能是ALT主要分布在肝細(xì)胞漿，而AST主要分布在肝細(xì)胞的線粒體中，SBWP修復(fù)受損肝細(xì)胞線粒體的作用不如在細(xì)胞漿中明顯，使受損線粒體中大量AST溶出[16]，其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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