潘興昌，印 虹，谷瑞增，徐亞光，蔡木易，孫桂菊

(1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100028；2.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 210009)

食物中的蛋白質(zhì)在機(jī)體的胃腸道內(nèi)消化，釋放出了很多肽類物質(zhì)。這些肽類物質(zhì)不僅是生命活動(dòng)中氨基酸的供體，而且它還賦予了蛋白質(zhì)更多的非營養(yǎng)學(xué)功能，其作為胃腸道的“腔內(nèi)信號(hào)分子”學(xué)說越來越被學(xué)術(shù)界所接受[1]。

以往的研究對(duì)于乳源生物活性肽[2]、大豆活性肽[3]報(bào)道的較多，而對(duì)于小麥肽的報(bào)道相對(duì)較少，目前小麥活性肽的制備、鑒定技術(shù)相對(duì)已經(jīng)比較成熟，已有的關(guān)于小麥肽的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小麥活性肽具有豐富的生物學(xué)功能，如：阿片活性[4-5]、抑癌活性[6]、抑制ACE活性[7-8]、抗氧化等。外文報(bào)道的有關(guān)小麥活性肽的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)幾乎是空白，僅有的國內(nèi)文獻(xiàn)對(duì)于小麥肽體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的報(bào)道也停留在現(xiàn)象觀察階段，如：鎮(zhèn)痛作用[9]、免疫調(diào)節(jié)[10]等，缺乏深入的研究。所以本實(shí)驗(yàn)通過灌胃不同劑量的小麥肽，觀察小麥肽對(duì)大鼠氮代謝、血生化、胃腸形態(tài)以及小腸部分酶活的影響，為揭示其是否作為信號(hào)分子參與生理活動(dòng)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；也為小麥肽作為一種功能性食品，更好地服務(wù)人類健康提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

清潔級(jí)SD大鼠50只，雄性，體質(zhì)量180～200g，購于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)：SCXK(浙)2008-0033)；標(biāo)準(zhǔn)鼠糧，購于南京市江寧區(qū)青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖場；大鼠飼養(yǎng)于東南大學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房。

小麥肽，由中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院提供，平均分子質(zhì)量小于1000D的低分子肽混合物，比例達(dá)到92%，基本上是由2～6個(gè)氨基酸構(gòu)成。

考馬斯亮藍(lán)蛋白濃度測試盒、Na+-K+-ATP酶活力測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他均為國產(chǎn)分析純。

K9860自動(dòng)凱氏定氮儀 中國海能儀器公司；LX20全自動(dòng)生化分析儀 美國貝克曼庫爾特公司；Hitachi S-3000N掃描電鏡、HCP22型臨界點(diǎn)干燥儀 日本日立公司；722N可見光分光光度計(jì) 上海精密儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和樣品采集

50只SD大鼠隨機(jī)分為5組，分別是空白對(duì)照組、低劑量小麥肽組(灌胃劑量為20mg/(kg·d))、中劑量小麥肽組(灌胃劑量為100mg/(kg·d))、高劑量小麥肽組(灌胃劑量為500mg/(kg·d))和小麥蛋白組(灌胃劑量為20mg/(kg·d))。低、中、高小麥肽劑量組每天用不同質(zhì)量濃度的小麥肽溶液1mL灌胃，小麥蛋白組每天用小麥蛋白溶液1mL灌胃，空白對(duì)照組大鼠每天按等體積蒸餾水灌胃，灌胃共30d。

灌胃實(shí)驗(yàn)開始前記錄大鼠初體質(zhì)量，第10、20、30天記錄所有大鼠體質(zhì)量、給料量、殘余料量，用代謝籠采集所有大鼠24h糞、尿樣品。每次收集的糞便稱質(zhì)量后按鮮質(zhì)量的5%加入10%硫酸溶液，并加少量甲苯防腐，保存于－20℃?zhèn)溆?；每次收集的尿液中?00mL加入2mL的10%硫酸溶液，加4滴甲苯用于防腐，保存于－20℃?zhèn)溆谩?0d后，股動(dòng)脈采血后頸部脫臼處死所有大鼠，取血清、胃、小腸黏膜組織，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 氮代謝測定指標(biāo)及方法[11]

根據(jù)第10、20、30天的給料量和殘余料量，計(jì)算攝食量。

凱氏定氮法測定樣品中粗蛋白質(zhì)含量(包括攝入氮、糞氮和尿氮)。

1.2.3 血清生化指標(biāo)的測定

全自動(dòng)生化分析儀測定大鼠血清中總蛋白、白蛋白、葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇的含量。

1.2.4 胃腸道內(nèi)表面掃描電鏡觀察

取材時(shí)，在胃竇處(十二指腸處)取一塊胃(小腸)組織放入生理鹽水中，輕輕洗滌，去除雜物。用體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛和體積分?jǐn)?shù)2%的四氧化鋨雙重固定，常規(guī)乙醇系列脫水，醋酸異戊酯過渡，在HCP22型臨界點(diǎn)干燥儀上干燥，噴金后在Hitachi S-3000N掃描電鏡下觀察。

1.2.5 胃、小腸組織蛋白含量的測定

按考馬斯亮藍(lán)蛋白濃度測試試劑盒說明書操作。

1.2.6 小腸黏膜氨基肽酶、Na+-K+-ATP酶活力的測定

樣本前處理：準(zhǔn)確稱取腸黏膜組織50mg，加入生理鹽水450μL制成10%的勻漿，3500r/min離心10min，取上清液再用生理鹽水按體積比1：4稀釋成2%的勻漿待測。

氨基肽酶活力的測定[12]：取2%的勻漿液20μL，加入5mmol/L L-亮氨酸-4-硝基苯胺0.2mL 50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.8) 0.4mL、蒸餾水0.38mL，37℃水浴60min；加入0.2mol/L醋酸鹽緩沖液(pH4.2) 3mL混勻，終止反應(yīng)；分光光度計(jì)(波長405nm)檢測吸光度。酶活力單位為每分鐘水解1μmol的底物所需的酶量，酶活力以U/mg pro表示。

Na+-K+-ATP酶活力測定按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差別有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮代謝相關(guān)指標(biāo)的測定結(jié)果

表 1 第10天大鼠氮代謝相關(guān)指標(biāo)的變化(±s，n=10)Table 1 Changes of the nitrogen metabolism index after 10 days of treatment(±s，n=10)

表 1 第10天大鼠氮代謝相關(guān)指標(biāo)的變化(±s，n=10)Table 1 Changes of the nitrogen metabolism index after 10 days of treatment(±s，n=10)

注：*.與空白對(duì)照組相比，有顯著性差異(P ＜0.05)。下同。

蛋白質(zhì)生物學(xué)價(jià)值/%空白對(duì)照組73±72.32±0.7543±658±7低劑量小麥肽組 72±62.22±0.7446±861±10中劑量小麥肽組 73±62.70±0.65* 48±864±8高劑量小麥肽組 72±72.10±0.6741±755±9小麥蛋白組70±82.07±0.70* 40±653±11分組 蛋白質(zhì)消化率/%氮沉積/(g/d)凈蛋白質(zhì)利用率/%

由表1可知，灌胃不同劑量小麥肽和小麥蛋白10d后，與空白對(duì)照組相比，中劑量小麥肽能顯著增加大鼠氮沉積(P＜0.05)，小麥蛋白能顯著減少大鼠氮沉積(P＜0.05)，低、高劑量小麥肽對(duì)大鼠氮沉積無明顯影響。低、中劑量小麥肽組凈蛋白質(zhì)利用率、蛋白質(zhì)生物學(xué)價(jià)值均高于空白對(duì)照組，但無顯著性差異。

表 2 第20天大鼠氮代謝相關(guān)指標(biāo)的變化(±s，n=10)Table 2 Changes of the nitrogen metabolism index after 20 days of treatment (±s，n=10)

表 2 第20天大鼠氮代謝相關(guān)指標(biāo)的變化(±s，n=10)Table 2 Changes of the nitrogen metabolism index after 20 days of treatment (±s，n=10)

蛋白質(zhì)生物學(xué)價(jià)值/%空白對(duì)照組73±72.98±0.6942±1257±7低劑量小麥肽組 78±63.22±0.7650±1663±9中劑量小麥肽組 74±63.00±0.6549±763±8高劑量小麥肽組 72±62.86±0.6742±1454±8小麥蛋白組70±62.23±0.75*37±1551±10分組 蛋白質(zhì)消化率/%氮沉積/(g/d)凈蛋白質(zhì)利用率/%

由表2可知，灌胃不同劑量小麥肽和小麥蛋白20d后，與空白對(duì)照組相比，小麥蛋白能顯著減少大鼠氮沉積(P＜0.05)，低、中、高劑量小麥肽對(duì)大鼠氮沉積無影響。低、中劑量小麥肽組凈蛋白質(zhì)利用率、蛋白質(zhì)生物學(xué)價(jià)值均高于空白對(duì)照組，但無顯著性差異。

表 3 第30天大鼠氮代謝相關(guān)指標(biāo)的變化(±s，n=10)Table 3 Changes of the nitrogen metabolism index after 30 days of treatment (±s，n=10)

表 3 第30天大鼠氮代謝相關(guān)指標(biāo)的變化(±s，n=10)Table 3 Changes of the nitrogen metabolism index after 30 days of treatment (±s，n=10)

蛋白質(zhì)生物學(xué)價(jià)值/%空白對(duì)照組75±63.56±0.5741±1354±15低劑量小麥肽組 83±7*4.11±0.73*59±7*68±6*中劑量小麥肽組 72±33.87±0.4150±468±5*高劑量小麥肽組 70±52.88±0.58*42±1359±14小麥蛋白組68±6*2.80±0.59*34±1450±15分組 蛋白質(zhì)消化率/%氮沉積/(g/d)凈蛋白質(zhì)利用率/%

由表3可知，灌胃不同劑量小麥肽和小麥蛋白30d后，與空白對(duì)照組相比，低劑量小麥肽能顯著提高大鼠蛋白質(zhì)消化率(P＜0.05)，小麥蛋白能顯著減少大鼠蛋白質(zhì)消化率(P＜0.05)，中、高劑量小麥肽對(duì)大鼠蛋白質(zhì)消化率無影響；低劑量小麥肽能顯著增加大鼠氮沉積(P＜0.05)，高劑量小麥肽、小麥蛋白能顯著減少大鼠氮沉積(P＜0.05)，中劑量小麥肽對(duì)大鼠氮沉積無影響；低劑量小麥肽能顯著增加大鼠凈蛋白質(zhì)利用率(P＜0.05)，中、高劑量小麥肽和小麥蛋白對(duì)大鼠凈蛋白質(zhì)利用率無影響；低、中劑量小麥肽均能顯著增加蛋白質(zhì)生物學(xué)價(jià)值(P＜0.05)，而高劑量小麥肽和小麥蛋白對(duì)大鼠的蛋白質(zhì)生物學(xué)價(jià)值均無影響。

2.2 血清生化指標(biāo)的測定結(jié)果

表 4 小麥肽對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響(±s，n=10)Table 4 Effect of wheat peptide on serum biochemical indicator in (±s，n=10)

表 4 小麥肽對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響(±s，n=10)Table 4 Effect of wheat peptide on serum biochemical indicator in (±s，n=10)

總膽固醇含量/(mmol/L)空白對(duì)照組 57.89±1.05 18.11±1.17 8.28±1.020.72±0.211.92±0.22低劑量小麥肽組60.40±2.72* 18.50±0.71 8.97±0.590.96±0.28* 2.09±0.28中劑量小麥肽組60.30±1.83* 18.40±1.58 8.29±1.680.77±0.191.95±0.25高劑量小麥肽組61.10±1.85* 17.60±1.90 8.30±0.940.75±0.211.89±0.34小麥蛋白組 58.40±1.26 18.90±1.29 8.72±0.810.76±0.262.04±0.21分組 總蛋白含量/(g/L)白蛋白含量/(g/L)葡萄糖含量/(mmol/L)甘油三酯含量/(mmol/L)

如表4所示，低、中、高劑量小麥肽組大鼠血清總蛋白含量均顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05)，而小麥蛋白組大鼠血清總蛋白與空白對(duì)照組相比無顯著性差異。低劑量小麥肽組大鼠血清甘油三酯含量要顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05)，中、高劑量小麥肽組和小麥蛋白組大鼠血清甘油三酯含量與空白對(duì)照組相比無顯著性差異。低、中、高劑量小麥肽組和小麥蛋白組大鼠血清白蛋白、葡萄糖、總膽固醇與空白對(duì)照組相比均無明顯差異。

2.3 胃腸道掃描電鏡結(jié)果

2.3.1 小麥肽對(duì)大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)的影響

圖 1 大鼠胃內(nèi)表面掃描電鏡結(jié)果的比較(×500)Fig.1 Scanning electron microscope images of gaster surface (×500)

如圖1所示，空白對(duì)照組胃表面平整，上皮細(xì)胞游離面細(xì)胞界限明顯，細(xì)胞間連接緊密，排列整齊，胃小凹分布均勻，開口處多近三角形或橢圓型。灌胃30d后，低、中劑量小麥肽對(duì)胃表面上皮細(xì)胞的生長有一定的促進(jìn)作用，體現(xiàn)為上皮細(xì)胞排列整齊有序，細(xì)胞間隙緊密，上皮細(xì)胞形態(tài)飽滿。高劑量小麥肽組和小麥蛋白組胃表面與空白對(duì)照組一致。

2.3.2 小麥肽對(duì)大鼠十二指腸黏膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)的影響

圖 2 大鼠十二指腸內(nèi)表面掃描電鏡結(jié)果的比較(×400)Fig.2 Scanning electron microscope images of dodecadactylon surface (×400)

如圖2所示，灌胃30d后，低、中劑量組大鼠的十二指腸絨毛生長情況要優(yōu)于空白對(duì)照組，主要表現(xiàn)為低、中劑量組大鼠十二指腸表面上皮細(xì)胞排列密集，且排列整齊有序，細(xì)胞間隙清晰，上皮細(xì)胞飽滿；而高劑量小麥肽和小麥蛋白組大鼠的腸絨毛生長情況與空白對(duì)照組一致。

2.4 胃腸組織蛋白含量的測定結(jié)果

圖 3 小麥肽對(duì)大鼠胃組織蛋白含量的影響(±s，n=10)Fig.3 Effect of wheat peptide on the protein level in gaster (±s，n=10)

圖 4 小麥肽對(duì)大鼠小腸黏膜蛋白含量的影響(±s，n=10)Fig.4 Effect of wheat peptide on the protein level in small intestine mucosa mucosa (±s，n=10)

如圖3、4所示，低、中、高劑量小麥肽組和小麥蛋白組大鼠胃組織蛋白含量與空白對(duì)照組相比無顯著性差異；另外低、中、高劑量小麥肽組和小麥蛋白組大鼠小腸黏膜組織中蛋白含量與空白對(duì)照組相比無顯著性差異。

2.5 小腸黏膜氨基肽酶、Na+-K+-ATP酶活力的測定結(jié)果

圖 5 小麥肽對(duì)大鼠小腸黏膜氨基肽酶活力的影響(±s，n=10)Fig.5 Effect of wheat peptide on aminopeptidase activity in small intestine mucosa (±s，n=10)

如圖5所示，低、中、高劑量小麥肽組大鼠小腸黏膜氨基肽酶活力要顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05)，小麥蛋白組大鼠小腸黏膜氨基肽酶活力與空白對(duì)照組相比無顯著性差異。

如圖6所示，中、高劑量小麥肽組大鼠小腸黏膜Na+-K+-ATP酶活力要顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05)，低劑量小麥肽和小麥蛋白組大鼠小腸黏膜Na+-K+-ATP酶活力與空白對(duì)照組相比無顯著性差異。

3 討 論

機(jī)體攝入的食物中的含氮營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)過體內(nèi)消化、吸收與代謝，一部分合成了機(jī)體內(nèi)蛋白，沉積于體內(nèi)或者被機(jī)體所利用，另一部分經(jīng)過代謝變?yōu)閺U棄產(chǎn)物隨尿等排出，構(gòu)成了機(jī)體的氮代謝[13]。糞中含有的氮和尿中的氮是攝入氮的兩個(gè)主要損失的部分，糞氮是經(jīng)過消化道之后而沒有被消化、吸收的部分，尿氮是被吸收以后的氨基酸或者小肽參與組織代謝后，沒有被利用合成機(jī)體內(nèi)蛋白而脫氨后由尿排出的部分。

蛋白質(zhì)消化率是動(dòng)物攝入的蛋白質(zhì)(或氮)減去糞中的蛋白質(zhì)(或氮)占攝入的蛋白質(zhì)(或氮)的百分比，可以衡量飼料蛋白質(zhì)被消化的程度。大鼠對(duì)飼料中蛋白質(zhì)利用率越低，則通過代謝糞氮損失的蛋白質(zhì)相對(duì)越多，消化的相對(duì)越少，消化率相對(duì)越低。灌胃30d后，低劑量小麥肽組蛋白質(zhì)消化率顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05)；而小麥蛋白組蛋白質(zhì)消化率要顯著低于空白組(P＜0.05)，Auricchio等[14]曾報(bào)道小麥蛋白與乳糜瀉(腹部疾病)的發(fā)病有很大的關(guān)聯(lián)，推測小麥蛋白有可能降低大鼠的蛋白質(zhì)消化率。

凈蛋白質(zhì)利用率是指動(dòng)物體內(nèi)沉積的蛋白質(zhì)(或氮)占食入的蛋白質(zhì)(或氮)的百分比，蛋白質(zhì)生物學(xué)價(jià)值是指體內(nèi)沉積的蛋白質(zhì)(或氮)占食物中被消化的蛋白質(zhì)(或氮)的百分比。凈蛋白質(zhì)利用率和蛋白質(zhì)生物學(xué)價(jià)值用來衡量飼料蛋白質(zhì)被利用的程度。Boze等[15]研究結(jié)果表明飼料中添加小肽，可顯著提高動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的利用率。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)灌胃10d和20d后，低、中劑量小麥肽均能提高大鼠凈蛋白質(zhì)利用率和蛋白質(zhì)生物學(xué)價(jià)值，并且灌胃30d后，低劑量小麥肽能顯著提高大鼠凈蛋白質(zhì)利用率和蛋白質(zhì)生物學(xué)價(jià)值，中劑量小麥肽能顯著提高大鼠蛋白質(zhì)生物學(xué)價(jià)值，與Boze報(bào)道一致；高劑量小麥肽和小麥蛋白對(duì)大鼠凈蛋白質(zhì)利用率和蛋白質(zhì)生物學(xué)價(jià)值均無影響，推測小麥肽作為一種信號(hào)分子參與調(diào)控機(jī)體利用食物中蛋白質(zhì)，體現(xiàn)了小麥肽的非營養(yǎng)學(xué)功能。

目前，胃腸腔內(nèi)食物的消化產(chǎn)物是胃、小腸上皮細(xì)胞生長的重要的刺激因素的觀點(diǎn)已被普遍接受。由于胃、小腸是機(jī)體與消化道內(nèi)營養(yǎng)微環(huán)境之間的重要界面，其形態(tài)和功能的改變受許多因素的影響，如內(nèi)分泌激素、胃腸調(diào)節(jié)蛋白、一些生長因子以及膳食營養(yǎng)等。Mane等[16]研究顯示，胃、小腸內(nèi)容物及消化產(chǎn)物可刺激胃與小腸上皮組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小麥肽對(duì)大鼠胃腸道上皮細(xì)胞的生長有一定的促進(jìn)作用，與王恬等的研究結(jié)果一致。

食物蛋白質(zhì)經(jīng)小腸腔內(nèi)消化液的消化后2/3的肽類物質(zhì)需進(jìn)一步經(jīng)小腸上皮細(xì)胞紋狀緣肽酶表面水解或轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞由細(xì)胞漿肽酶水解后才被吸收。因此小腸黏膜紋狀緣氨基肽酶是蛋白質(zhì)消化的關(guān)鍵酶[16]。氨基肽酶廣泛分布在小腸黏膜上皮細(xì)胞的紋狀緣上，氨基肽酶是一種蛋白質(zhì)水解酶，能水解蛋白質(zhì)和多肽的N末端氨基酸，使蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物進(jìn)一步水解為肽與氨基酸，對(duì)飼料蛋白質(zhì)的充分消化吸收和氮的利用方面具重要作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同劑量的小麥肽均能顯著提高大鼠小腸黏膜氨基肽酶的活力。大部分營養(yǎng)物質(zhì)(例如氨基酸、葡萄糖)的吸收是在通過小腸黏膜進(jìn)行[17]，氨基酸的吸收屬于主動(dòng)運(yùn)輸，需要Na+-K+-ATP酶來提供能量。本研究結(jié)果顯示中、高劑量的小麥肽均能顯著提高大鼠的Na+-K+-ATP酶活力。提示小麥肽可能是通過上調(diào)這兩種酶的活性來增加腸道內(nèi)肽和氨基酸的生成和吸收的。另外本實(shí)驗(yàn)的血清生化指標(biāo)結(jié)果顯示，低、中、高劑量小麥肽均能顯著提高大鼠血清總蛋白的水平，也提示小麥肽對(duì)機(jī)體對(duì)于蛋白質(zhì)的生物利用是有影響的。

本研究結(jié)果也證實(shí)了小麥蛋白本身沒有影響大鼠氮代謝、血生化、胃腸形態(tài)與功能的作用。由于小麥活性肽是以無活性的形式隱藏在小麥蛋白的氨基酸序列中，必須通過適當(dāng)?shù)拿附猓谝欢l件下才能釋放出來，發(fā)揮其豐富的生物學(xué)功能。故研究認(rèn)為小麥肽是發(fā)揮生物學(xué)作用的主要有效成分。

綜上所述，小麥活性肽處理組大鼠在蛋白質(zhì)消化率、凈蛋白質(zhì)利用率和生物學(xué)效價(jià)等指標(biāo)上的提高，增加了機(jī)體對(duì)于食物蛋白質(zhì)的消化與利用，可能與其能促進(jìn)胃腸道上皮細(xì)胞的生長，另外其能上調(diào)大鼠小腸黏膜的氨基肽酶、Na+-K+-ATP酶的活性有關(guān)。而小麥蛋白本身無以上作用。本研究中涉及的分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

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