張金玲，鐘耀廣,*，萬金慶，喬勇進

(1.上海海洋大學食品學院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2.上海市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工研究中心，上海 201403)

羊棲菜廣泛分布于我國沿海地區(qū)，是一種營養(yǎng)豐富的食用藻類，并且具有多種藥用價值[1]，但羊棲菜中高含量的砷對人體危害很大。在自然界中，砷以無機砷和有機砷兩種形式存在，各種價態(tài)與形態(tài)的砷化物毒性相差很大[2-3]，其中，As2O3屬劇毒物，據(jù)上海市衛(wèi)生防疫站對小鼠的LD50口服實驗得出，無機砷中的As2O3含量為22.9～27.7mg/kg，而有機砷中甲基胂酸鋅的含量折算成As2O3進行比較，其毒性小了7倍多，毒性相對較低[4]。因而，目前國際上常以無機砷含量進行衛(wèi)生學評價。羊棲菜等海藻類物質(zhì)對砷的富集較強[5]，海水中砷含量為3～6mg/kg，羊棲菜能將砷濃縮3～6萬倍，據(jù)朱亞爾等[6]報道，羊棲菜中無機砷含量為45.53mg/kg，GB 2762—2005《食品中污染物限量》中規(guī)定海藻中無機砷不大于1.5mg/kg[7]，羊棲菜中無機砷含量常常超標，所以，在羊棲菜的利用和加工中必須及時檢測和有效地控制無機砷含量。無機砷的檢測中關(guān)鍵問題是無機砷的有效提取，提取時既要破壞對無機砷有吸附、配合作用的有機質(zhì)，使提取完全，又要避免在提取過程中，試樣中有機砷轉(zhuǎn)化成無機砷[8]。用鹽酸浸提能破壞有干擾的有機質(zhì)，同時，鹽酸可與無機砷生成待測的氣態(tài)砷化氫的中間產(chǎn)物氯化砷，所以采用鹽酸浸提法是可取的[9-10]。

響應面法(response surface methodology，RSM)是利用合理的試驗設(shè)計方案，采用多元二次回歸方程擬合多個因素與多個響應值之間的函數(shù)關(guān)系，通過回歸方程尋求最佳工藝參數(shù)[11]。目前，響應面分析法被廣泛用于提取工藝優(yōu)化的研究，例如吳功慶等[12]采用響應面分析法對月季花多糖提取工藝進行優(yōu)化研究，Sinha等[13]采用響應面法對花瓣中天然染料的提取工藝進行優(yōu)化研究。董旭等[14]研究了響應面優(yōu)化法用纖維素酶提取山核桃蒲多酚類物質(zhì)，建立了四因素三水平的響應面設(shè)計方法，得到纖維素酶法提取山核桃蒲多酚的二次多項數(shù)學模型。

目前，超聲輔助法提取羊棲菜中無機砷的研究未見報道，本實驗采用該法對羊棲菜中無機砷進行提取，并通過響應面分析法對相關(guān)工藝參數(shù)進行了優(yōu)化，為羊棲菜的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊棲菜樣品產(chǎn)于浙江溫州。

6mol/L鹽酸；2g/100mL硼氫化鉀+0.5g/100mL氫氧化鈉溶液，臨用前現(xiàn)配；5g/100mL硫脲+5g/100mL抗壞血酸溶液，臨用前現(xiàn)配。

砷標準溶液：編號GBW(E)080622，0.100g/L，上海市計量測試技術(shù)研究院。砷標準使用液：吸取砷標準溶液用0.6mol/L鹽酸稀釋至1.0μg/mL。實驗所用玻璃儀器用2mol/L硝酸浸泡24h以上；實驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

AFS-9130型順序注射雙道原子熒光光度計 北京吉天儀器有限公司；專用砷編碼空心陰極燈 北京有色金屬研究總院；SK3310HP型科導超聲波清洗器 上?？茖С晝x器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原理

在一定的超聲波條件下，用鹽酸浸提羊棲菜中的無機砷，在浸提后的溶液中加入抗壞血酸-硫脲，把五價砷還原成三價砷，在酸性介質(zhì)中，以硼氫化鉀或硼氫化鈉為還原劑，將三價砷轉(zhuǎn)化為砷化氫，由載氣(高純氬氣)帶入石英原子化器，受熱分解為原子態(tài)砷，在特種砷空心陰極燈的照射下產(chǎn)生原子熒光，熒光強度與一定濃度范圍的砷溶液呈正比，與標準系列比較定量[15-17]。

1.3.2 測量條件

儀器測量參數(shù)見表1。

表1 原子熒光法測量參數(shù)Table 1 Working condition for AFS

1.3.3 樣品處理

將羊棲菜(鮮樣含水量約78%)樣品搗碎，稱取0.2g(稱準至0.001g)左右于25mL具塞比色管中，用6mol/L鹽酸溶液定容，混勻。置于預熱過的超聲波中，使樣品充分浸提，取出冷卻，過濾，若混濁再次過濾，獲得待測溶液。

1.3.4 樣品測定

取待測溶液4mL于10mL具塞比色管中，加5g/100mL硫脲+5g/100mL抗壞血酸溶液1mL，正辛醇5～8滴，用去離子水定容，搖勻放置20min后待測。根據(jù)1.3.2節(jié)調(diào)整儀器工作參數(shù)，預熱20～30min后開始測量，依次進行標準系列測量和樣品測量，同時做試劑空白實驗。

1.3.5 標準系列繪制

吸取一定量砷標準儲備液(1.0μg/mL)稀釋配制2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μg/L的系列砷標準溶液，分別加入5g/100mL硫脲+5g/100mL抗壞血酸溶液1mL，正辛醇5～8滴，用0.6mol/L的鹽酸定容后混勻，靜置20min，測定其熒光強度，以熒光強度(y)為縱坐標，無機砷質(zhì)量濃度(x，ng/mL)為橫坐標，作得標準曲線為：y=44.648x－8.4213(R2=0.9995)。

1.3.6 無機砷含量計算

試樣中無機砷含量參照以下公式進行計算。

式中：X為試樣中無機砷含量/(mg/kg)；ρ1為試樣測定液中無機砷的質(zhì)量濃度/(ng/mL)；ρ2為試劑空白質(zhì)量濃度/(ng/mL)；m為試樣的質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 浸提液濃度對熒光強度的影響

砷元素對酸的要求不是很高，在鹽酸介質(zhì)中有較穩(wěn)定的熒光強度。分別采用3、4、5、6、7mol/L優(yōu)級純的鹽酸溶液用超聲波(工作頻率59kHz、功率密度0.4W/cm2、溫度50℃)提取同一種羊棲菜樣品20min，在相同儀器條件下測定熒光強度，結(jié)果見圖1。當鹽酸濃度為6mol/L時，熒光強度較高。鹽酸濃度過小，則提取的無機砷不完全，熒光強度小。當鹽酸濃度超過6mol/L時，儀器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性變差，熒光強度變小[18]。所以，本實驗選用6mol/L的鹽酸為提取劑。

圖 1 浸提液濃度對熒光強度的影響Fig.1 Effect of hydrochloric acid concentration on the fl uorescence intensity

圖 2 提取溫度對熒光強度的影響Fig.2 Effect of temperature on the fl uorescence intensity

2.1.2 提取溫度對熒光強度的影響

在樣品用量一定，超聲波工作頻率59kHz、功率密度0.4W/cm2的條件下提取20min，改變提取溫度進行實驗，結(jié)果如圖2所示。隨著提取溫度的升高，羊棲菜中無機砷提取液的熒光強度也升高，但當溫度高于50℃后，溶液的熒光強度沒有顯著增加[19]，因此實驗選擇提取溫度為50℃。

2.1.3 提取時間對熒光強度的影響

圖 3 提取時間對熒光強度的影響Fig.3 Effect of extraction time on the fl uorescence intensity

在樣品用量一定，超聲波工作頻率59kHz、功率密度0.4W/cm2、溫度50℃條件下，采用不同的提取時間進行實驗，結(jié)果見圖3。隨著超聲提取時間的延長，羊棲菜中無機砷提取液的熒光強度增加，當提取時間延長到20min后，提取液的熒光強度趨于穩(wěn)定，因此實驗選擇提取時間為20min。

2.2 響應面試驗結(jié)果

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定最佳條件為浸提液鹽酸濃度6mol/L、提取溫度50℃、提取時間20min。在此基礎(chǔ)上根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，綜合單因素試驗所得結(jié)果，選取浸提液濃度(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)3個因素，進行響應面分析，試驗設(shè)計因素編碼及水平見表2，試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表2 試驗設(shè)計因素編碼及水平Table 2 Variables and their coded values for Box-Behnken design

表3 Box-Behnken試驗結(jié)果Table 3 Results of Box-Behnken central composite experimental

表4 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗Table 4 Analysis of variance and significance test of the regression model

由表4可知，整體模型的顯著性由F檢驗來判定，F(xiàn)=17.69，回歸模型的R2＝0.9579，表明回歸模型的擬合度很好，響應值的95.79%是由所選變量引起的。顯著性水平P＜0.01，表明模型極顯著，此外，模型方差失擬項P＝0.1223＞0.05，不顯著，說明這種試驗方法可靠，回歸方程對試驗結(jié)果擬合情況較好。從表4可以看出，所考察的因素A、B及C所對應的P值均小于0.05，說明浸提液濃度、提取溫度、提取時間對于熒光強度有顯著影響，且顯著性大小的排序為浸提液濃度＞提取溫度＞提取時間。

利用Design-Expert統(tǒng)計軟件對表4中試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，由Box-Behnken程序計算得到以下回歸方程：

Y=651.28＋53.55A＋38.16B＋18.84C＋4.75AB－8.13AC－12.27BC－42.87A2－59.36B2－59.63C2

2.2.2 響應面分析

根據(jù)回歸方程，作響應曲面圖，考察所擬合的響應曲面的形狀，分析浸提液濃度、提取溫度、提取時間對熒光強度的影響。響應曲面及其等高線如圖4所示，從響應面的最高點和等值線可以看出，在所選的范圍內(nèi)存在極值，即是響應面的最高點和等值線的中心。為進一步求得各因素的最優(yōu)條件，對回歸方程進行數(shù)學處理，令一階偏導數(shù)為0，求得A、B、C所對應的編碼值為0.634、0.339、0.081，將該條件代入模型方程，得熒光強度為675.51，根據(jù)模型計算出的無機砷最佳提取條件為：浸提液濃度6.6mol/L、提取溫度53.4℃、提取時間24.4min。

圖 4 各因素交互作用對熒光強度的響應面和等高線Fig.4 Response surface and contour plots showing the effects of extraction time and temperature on fl uorescence intensity

2.3 驗證實驗

按照響應面分析法設(shè)計優(yōu)化無機砷提取的最佳工藝條件，對響應面分析法的可靠性重復進行5次平行實驗發(fā)現(xiàn)，熒光強度分別為657.41、643.13、670.80、652.11和676.49，熒光強度的平均值為659.99(無機砷含量為4.69mg/kg)，與理論預測值675.51(無機砷含量為4.78mg/kg)的相對誤差為1.87%。

3 討 論

3.1 本研究采用超聲波輔助法提取羊棲菜中無機砷，與傳統(tǒng)的國標水浴法提取相比，該方法有很多優(yōu)點。水浴法需要在60℃提取18h，超聲波輔助法在50℃提取僅需20min，提取時間短、溫度較低，具有方便、快速、節(jié)能等優(yōu)點。本方法檢測羊棲菜中無機砷含量為4.78mg/kg，國標水浴法為4.81mg/kg，該法得到的數(shù)據(jù)與國標法相近。因此，超聲輔助法提取效果好，方法可行性強。

3.2 超聲輔助提取法能較好地提取出羊棲菜中的無機砷，但由于產(chǎn)地不同、季節(jié)不同，羊棲菜中無機砷含量也會稍有差異，有待進一步研究。經(jīng)檢測羊棲菜中的無機砷含量高于其他海藻(海帶、紫菜等)[20]，所以食用未經(jīng)加工過的羊棲菜一般需要長時間用水浸泡，以降低無機砷含量。

3.3 當浸提液酸濃度比較高時，經(jīng)過儀器測量的熒光強度不穩(wěn)定，平行實驗波動較大。

3.4 本實驗采用的超聲清洗機是槽式超聲波清洗機，其頻率是固定的，今后有待從超聲頻率以及超聲聲強、超聲發(fā)射方式(探頭式和槽式)等方面進一步開展研究。

4 結(jié) 論

4.1 超聲波輔助法提取羊棲菜中無機砷，與傳統(tǒng)的國標水浴法提取相比，優(yōu)點較多。該法提取時間短、溫度較低，具有方便、快速、節(jié)能等優(yōu)點。

4.2 本實驗研究了3個單因素對超聲輔助提取無機砷的熒光強度影響后，再采用Box-Behnken試驗對因素和水平進行優(yōu)化，得出最佳提取工藝條件為浸提液鹽酸濃度6.6mol/L、超聲波提取溫度53.4℃、超聲波提取時間24.4min，在此工藝條件下，熒光強度的理論值為675.51，經(jīng)驗證的實際測得值為659.99，相對誤差為1.87%。

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