李永剛，曾偉偉，王 慶，殷 亮，王英英，石存斌，吳淑勤＊

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部漁藥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510380；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306）

由草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）引起的草魚出血病給我國(guó)草魚養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，每年由于草魚出血病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失至少達(dá)10億人民幣［1-2］，這嚴(yán)重影響了草魚養(yǎng)殖者的積極性和我國(guó)淡水養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，該病病原及其防控技術(shù)的研究多次被列為國(guó)家科技攻關(guān)項(xiàng)目。GCRV隸屬水生呼腸孤病毒屬，為呼腸孤病毒科新成員，是中國(guó)大陸分離的第一株魚類病毒，也是已知的水生呼腸孤病毒屬中致病力最強(qiáng)的病毒［3］，可使魚種階段的草魚死亡率達(dá)到90%以上，還能感染青魚、麥穗魚、布氏鰲條魚和稀有鮈鯽等，并能使這幾種魚出現(xiàn)出血病癥狀而死亡［4-5］。目前，已報(bào)道的 GCRV 有20多個(gè)分離株［6-10］，不同分離株在致細(xì)胞病變、毒力、基因組電泳帶型、基因組序列和特征等各方面有較大差異。GCRV是雙鏈RNA （double-stranded RNA，dsRNA）病毒，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，變異迅速，因此，由GCRV引起的草魚出血病很難防治。對(duì)GCRV的深入研究有助于更清楚的認(rèn)識(shí)草魚病毒性出血病，對(duì)該病的防控具有重要的指導(dǎo)意義。近幾年對(duì)GCRV的病原學(xué)特性、基因組特征、蛋白及其功能、致病機(jī)理、細(xì)胞培養(yǎng)特性、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)等方面的研究，已經(jīng)積累了大量資料，為GCRV的進(jìn)一步深入研究和草魚出血病防控產(chǎn)品及技術(shù)的研制奠定了基礎(chǔ)。本文就草魚呼腸孤病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展做簡(jiǎn)要綜述，以期為草魚呼腸孤病毒進(jìn)一步深入研究和草魚出血病的防控提供參考。

1 草魚呼腸孤病毒一般生物學(xué)特性

GCRV是具有雙層衣殼、無囊膜、立體對(duì)稱的20面體球形顆粒，主要由蛋白質(zhì)和核酸組成，還含有少量以糖蛋白的形式存在的糖類，不含脂類［11］。GCRV對(duì)溫度有一定的穩(wěn)定性，柯麗華等將GCRV接毒懸液經(jīng)不同溫度、不同時(shí)間處理，測(cè)其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（median tissue culture infective dose，TCID50），通過TCID50的變化得出，GCRV對(duì)溫度有一定的穩(wěn)定性，56℃條件下放置30min，其活性變化不大；反復(fù)凍融和保存溫度對(duì)病毒的毒力影響較大［12］。用乙醚、氯仿等處理GCRV接毒懸液后，測(cè)得效價(jià)沒有明顯差異，后經(jīng)證實(shí)該病毒不含脂類，故對(duì)脂溶性溶劑不敏感。GCRV對(duì)酸堿具有一定的穩(wěn)定性，對(duì)酸 （pH 3）、堿 （pH10）處理不敏感。完整的病毒在氯化銫中的浮力密度約為1.36g／mL，在蔗糖中浮力密度為1.305g／mL，沉降系數(shù)為550S，用胰蛋白酶或精氨酸酶處理GCRV，病毒滴度略有上升。病毒核心能合成RNA聚合酶，該酶在28℃活性最強(qiáng)，能維持14h以上。GCRV其他毒株均有類似的結(jié)構(gòu)，不同毒株病毒顆粒大小在相關(guān)報(bào)道中有較大的差異，直徑范圍在55nm～82nm。GCRV的核心結(jié)構(gòu)在二級(jí)結(jié)構(gòu)水平上與其他呼腸孤病毒成員呈現(xiàn)高度相似性，說明病毒雙鏈RNA的相互作用及轉(zhuǎn)錄是高度保守的；而參與宿主識(shí)別和吸附作用的外殼結(jié)構(gòu)蛋白則表現(xiàn)為極低的相似性［1］。GCRV中的RNA移位裝置處于開放狀態(tài)，并且缺少哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒中位于移位裝置頂端相應(yīng)的信號(hào)蛋白［11］。

2 草魚呼腸孤病毒基因組特征

GCRV基因組由11個(gè)dsRNA節(jié)段組成，不同的毒株之間，病毒基因組的總分子質(zhì)量差異不大，而各節(jié)段分子質(zhì)量有差異。GCRV基因組的11個(gè)片段根據(jù)凝膠電泳遷移率可分為3組，即大片段（L1，L2，L3）、中等片斷（M4，M5，M6）、較小片段（S7，S8，S9，S10，S11），從全基因組測(cè)序結(jié)果也證實(shí)這一點(diǎn)，大片段在3 600bp～4 200bp之間，中片段在2 000bp～2 400bp之間，小片段在700bp～1 700 bp之間。每個(gè)dsRNA片段都有一個(gè)或一個(gè)以上開放性閱讀框（open reading frame，ORF），各片段和編碼蛋白是一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。

全基因組序列信息和特征是病毒基因分型、揭示強(qiáng)弱毒株基因差異、探討病毒遺傳變異規(guī)律以及可能的感染和傳播機(jī)制的基礎(chǔ)。至今有報(bào)道和GenBank中能搜索到的完成全基因組測(cè)序的GCRV只有6株，分別是GCRV-873、GCRV-991、AGCR-V［3］、GCRV-HZ08［13］、GCRV-104和 GCRVGD108［10］，其他一些毒株只完成了某些節(jié)段的基因序列分析，各片段堿基數(shù)見表1。根據(jù)這些毒株的部分序列進(jìn)行核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)以及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，表明所有毒株總體上可以分為3大類，即草魚呼腸孤病毒至少應(yīng)該存在3個(gè)基因型。不同類型的毒株其各節(jié)段核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性在1.6%～56%不等［6］，而同一類型的毒株其各節(jié)段核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性都大于90%［14］。

GCRV基因組各節(jié)段基因RNA的3′端不含poly（A）尾巴，每個(gè)片段在5′和3′末端都含有特異的4bp～6bp的重復(fù)保守序列，不同的節(jié)段和不同毒株，其5′和3′末端稍有差異（表2），如GCRV-873保守序列為5′-GUUAUUU……UUCAUC-3′，其中S11的5′保守序列為5′-GUUAUUG；GCRV-HZ08和GCRV-GD108保守序列為：5′-GUAAUUU……UUCAUC-3′，其中GCRV-HZ08的S8片段3′末端保守序列為：UGCAUC-3′，GCRV-GD108的S4片段 5′-GUAUUUU，S4 的 5′保 守 序 列 為 5′-GUAUUUU ，S5的5′保守序列為5′-GUAACUU，S7的5′保守序列為5′-GUAAUUC。GCRV-104株的各節(jié)段的保守序列差異較大，除S3、S9和S11的5′保守序列為5′-GAAUUAA，其余片段5′保守序列為5′-GAAUUUA，3′各片段的保守性差異較大，其中S1、S6、S8、S9、S11為 GUCAUC-3′，S2、S4、S5、S7 為 CUCAUC-3′，S3 為 AUCAUC-3′，S10 為UUCAUC-3′。AGCRV 保守序列為 5′-GUUUUAA……UUCAUC-3′，其中S4、S5、S9和S11的5′為5′-GUUUUAU，S4的3′保守序列為 AUCAUC-3′。

表1 不同分離毒株各片段的堿基數(shù)Table 1 The number of bases in each segment of different viral strains

3 草魚呼腸孤病毒蛋白及其功能

GCRV各基因組片段與編碼蛋白的基本上是一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，現(xiàn)在已經(jīng)確認(rèn)的GCRV基因組有11個(gè)片段，但是編碼12種多肽，其中7種為結(jié)構(gòu)多肽，命名為VP1-VP7，5種為非結(jié)構(gòu)多肽，命名為NS1-NS5，也有直接命名為V1-V12。構(gòu)成病毒蛋白質(zhì)雙層衣殼的蛋白組分是 VPl、VP3、VP5、VP6、VP7，VP2和VP4是微量結(jié)構(gòu)蛋白。其中5種非結(jié)構(gòu)蛋白分別是NS80、NS38、NS31、NS26、NS16。也有按病毒多肽加多肽分子質(zhì)量大小命名的，如王煒等根據(jù)GCRV-875病毒多肽的分子質(zhì)量大小，將其分為3個(gè)組，第1組為VP130（VP表示病毒多肽，數(shù)據(jù)為分子質(zhì)量，單位為ku，即130ku，下同）、VP120、VP113和VP107，第2組為VP75、VP65、VP60和VP52，第3組為VP42、VP39和VP31。基因組及其所編碼的多肽鏈的研究結(jié)果表明，GCRV-873基因組節(jié)段L1、L2、L3、M4、M5和S10分別編碼病毒核心衣殼的6種多肽，即 VP130、VPI15、VP100、VP90、VP80和VP36，節(jié)段M6和S7分別編碼病毒外層衣殼的結(jié)構(gòu)多肽VP73和VP67，節(jié)段S8和S9分別編碼分子質(zhì)量為52ku和41ku的多肽鏈；節(jié)段S11編碼分子質(zhì)量分別為29ku和19.5ku的兩種多肽鏈。

表2 GenBank收錄全基因序列毒株的兩端保守序列Table 2 The end conserved sequence of the complete genome in different viral strains included in GenBank

GCRV基因組編碼的多肽多與病毒粒子的結(jié)構(gòu)多肽分子質(zhì)量基本是一致的，但是有個(gè)別分子質(zhì)量大小不一致，如GCRV-873基因片段S8、S9和S11編碼的多肽鏈與病毒衣殼中的結(jié)構(gòu)多肽鏈在分子質(zhì)量上就有所差異（S8、S9編碼多肽為52ku、41 ku，而結(jié)構(gòu)多肽為VP50、VP43；S11編碼2條多肽，而結(jié)構(gòu)多肽為VP27），其他多肽鏈大小都是一致的。節(jié)段S8、S9和S11編碼的這些多肽鏈被推測(cè)，可能為結(jié)構(gòu)多肽的非成熟中間產(chǎn)物，需要在宿主細(xì)胞內(nèi)通過后加工造成分子質(zhì)量的增大或減小，抑或?yàn)榉墙Y(jié)構(gòu)多肽，有待于進(jìn)一步深入研究。

不同毒株間的同源性比較有助于對(duì)毒株更清晰的認(rèn)識(shí)，對(duì)了解毒株基因的來源也具有重要意義。現(xiàn)有資料報(bào)道HZ08與AGCRV各片段編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列同源性在14%～45%之間，HZ08與GCRV-873各片段編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列同源性在11%～46%之間［6］，其他毒株間同源性比較未見報(bào)道。

現(xiàn)在對(duì)GCRV編碼蛋白生物學(xué)功能的研究還不夠系統(tǒng)，但是其他呼腸孤病毒的研究成果對(duì)推斷GCRV編碼蛋白的生物學(xué)功能有一定的指導(dǎo)意義，根據(jù)呼腸孤病毒家族中同源蛋白功能相似的原則，對(duì)GCRV編碼蛋白的功能已經(jīng)初步明確，但是還需要更加系統(tǒng)的研究才能對(duì)其功能有更加深刻的認(rèn)識(shí)。根據(jù)已有的研究，已得知VP1是形成跨越內(nèi)外兩層蛋白層的開放通道，具有甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，可以帽化轉(zhuǎn)錄的RNA，在鳥苷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)中，其組氨酸發(fā)生質(zhì)子化，可增強(qiáng)VP1活性［15］；VP2和VP4含量少，結(jié)合在病毒基因組上，不是蛋白質(zhì)雙層衣殼的組分，分別具有RNA多聚酶和NTP酶的活性［11］；VP3是構(gòu)成內(nèi)層蛋白層的基本骨架，具有NTPase及解旋酶活性，可以綁定dsRNA；VP5和VP7形成異源二聚體，600個(gè)二聚體構(gòu)成完整病毒的外衣殼蛋白，VP5擁有Asn-42-Pro-43蛋白水解位點(diǎn)，可能在病毒感染中起到諸如細(xì)胞滲透的作用，VP7含有1個(gè)鋅指序列，可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)，與病毒感染細(xì)胞的吸附有關(guān)；一個(gè)GCRV病毒粒子含有120個(gè)VP6，內(nèi)外兩層衣殼通過VP6相互作用，對(duì)內(nèi)層VP3骨架蛋白分子起穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用，對(duì)釘狀突起蛋白起弱相互作用；NS80含有coiled coil彎曲片段，可以形成多聚體，在病毒早期形態(tài)發(fā)生階段起作用；NS38是形成包涵體的引發(fā)因子，和NS80共同作用形成病毒加工工廠——包涵體；NS31是病毒在細(xì)胞中形成后釋放階段起作用，與病毒粒子的釋放、擴(kuò)散和細(xì)胞融合密切相關(guān)［16］；NS26是水生呼腸孤病毒特有的蛋白質(zhì)，沒有同源蛋白，含ATP-依賴性的RNA解螺旋酶功能性位點(diǎn)。

4 草魚呼腸孤病毒細(xì)胞培養(yǎng)特性研究

病毒研究離不開細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒對(duì)研究病毒的生物學(xué)特性、致病歷程、致病機(jī)理和病毒保存等具有重要意義。王迎喜等［17］、邱濤等［18］的研究表明，GCRV能感染細(xì)胞并能在細(xì)胞中大量增殖，同時(shí)產(chǎn)生合胞體狀細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）?，F(xiàn)在針對(duì)GCRV已經(jīng)建立了很多草魚細(xì)胞系，如草魚腎細(xì)胞系（CIK、GCK-8），草魚肝細(xì)胞系（L8824），草魚性腺細(xì)胞系（CO、GCO），草魚腦細(xì)胞系（CIB），草魚吻端細(xì)胞系（PSF、ZC-7901），草魚鰭條細(xì)胞系（CF、CFS），草魚鰾細(xì)胞系（GSB），草魚胚胎細(xì)胞系（CP-80、GCB）等。

已報(bào)道的 GCRV 有20多株［7，9，19］。研究顯示，毒株不同，感染相同細(xì)胞的特征不同，不同毒株接種同一細(xì)胞，有的毒株可感染細(xì)胞產(chǎn)生CPE，而有的毒株感染細(xì)胞并不產(chǎn)生CPE，但都能在培養(yǎng)細(xì)胞中復(fù)制。不同毒株在不同細(xì)胞中病變也不同，如：GCRV-873能夠引起CIK、CAB、FHM 和GCO產(chǎn)生典型的細(xì)胞病變；GCRV-V（越南分離毒株）、GCRV-HZ08和GCRV-9014在CIK、CAB、FHM、GCO、EPC和CCO中不出現(xiàn)細(xì)胞病變，GCRV-V盲傳3代后能檢測(cè)到病毒粒子；GCRV-991能在CIK和FHM細(xì)胞系上能很好的增殖，而在EPC上不能生長(zhǎng)；這些毒株在哺乳動(dòng)物BHK、Vero細(xì)胞系上不能生長(zhǎng)［20］。不同株GCRV感染細(xì)胞的能力與其感染魚體的毒力存在差異，有的毒株（如GCRV-873）對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的感染力較強(qiáng)，但是對(duì)魚體的毒力卻較弱，有的毒株恰恰相反（如 GCRV-861）。另外，GCRV對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的特異性往往較對(duì)魚體的特異性差，例如，GCRV不能感染團(tuán)頭魴但能感染其組織細(xì)胞系BCC。不同類型的GCRV毒株感染不同的敏感細(xì)胞，均能從其維持液中直接提取到該病毒的核酸。一定濃度的精氨酸處理病毒吸附過程，以及采用細(xì)胞和病毒共培養(yǎng)的方法，可提高GCRV在CIK細(xì)胞上的培養(yǎng)滴度［11］。

不同基因類型的毒株接種細(xì)胞后病變表型不同。以GCRV-873和GCRV-HZ08為例，GCRV-873接種細(xì)胞后，需要一個(gè)適應(yīng)的培養(yǎng)過程，在第1代至第3代的感染培養(yǎng)物中，病變不明顯，往往沒有CPE，但隨著病毒傳代感染力逐漸增強(qiáng)，病變才逐漸明顯；而HZ08接種細(xì)胞一直都沒有CPE產(chǎn)生。病毒在細(xì)胞中增殖都有周期性，從體外培養(yǎng)的GCRV-873增殖情況總體上來看，在體外細(xì)胞培養(yǎng)中的最適增殖溫度為28℃，一般感染12h后即開始增殖，24h～72h大量增殖，培養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)典型的CPE，5 d左右達(dá)到最大增殖，此時(shí)病毒的滴度最高，以后逐漸趨于平緩。HZ08接種細(xì)胞后，不出現(xiàn)明顯CPE，無法對(duì)接毒后的細(xì)胞做定性描述。劉寶芹等［21-22］用FQ-PCR對(duì)GCRV-HZ08株病毒在不同細(xì)胞系中的增殖情況定量分析，結(jié)果表明，GCRV-HZ08株接種細(xì)胞增殖后，終濃度與初始接種濃度呈正相關(guān)。在28℃條件下，分別以GCRV-HZ08和GCRVJX09-01感染CIK細(xì)胞96h后病毒的拷貝數(shù)對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以細(xì)胞培養(yǎng)液pH為橫坐標(biāo)作相關(guān)曲線，兩條曲線的變化規(guī)律一致，即兩株病毒的增殖情況和培養(yǎng)液pH之間的變化關(guān)系是一致的pH 5～9條件下，96h后病毒拷貝數(shù)處于較高水平；而在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下病毒的拷貝數(shù)相應(yīng)較低；10種不同細(xì)胞對(duì)GCRV-HZ08株增殖量最大的細(xì)胞是GSB，增殖量達(dá)8.966 0×106拷貝／μL，顯著高于病毒含量?jī)H次于GSB的CIK（4.614 9×106拷貝／μL）。劉寶芹等［12］還對(duì)GCRV-JX09-01在10種細(xì)胞中的增殖情況進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明，該毒株在各種細(xì)胞中產(chǎn)生的病變效應(yīng)與GCRV-873毒株類似，只是與873株相比，其增殖量最大的細(xì)胞系是GSB，而不是CIK。GCRV-JX09-01和GCRV-HZ08兩種不同毒株在不同細(xì)胞中的培養(yǎng)特性和增殖情況見表3［22］。

5 草魚呼腸孤病毒致病機(jī)理

GCRV的侵染分為潛伏期、前驅(qū)期、明顯期和轉(zhuǎn)歸期（痊愈期或死亡）四個(gè)階段。潛伏期魚無明顯表觀現(xiàn)象，活動(dòng)與攝食正常，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短與水溫及病毒濃度密切相關(guān)。前驅(qū)期時(shí)間較短，僅1d～2d，病魚最早出現(xiàn)尾鰭末端發(fā)黑，體表暗黑色，停止攝食，離群緩游等癥狀；明顯期病魚出現(xiàn)明顯出血癥狀，離群獨(dú)游，對(duì)水流反應(yīng)遲鈍或沉于水底，有時(shí)身體失去平衡在水面打轉(zhuǎn)，一般1d左右死亡。

我國(guó)魚病防治工作者長(zhǎng)期以來對(duì)GCRV感染草魚后的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了研究。在GCRV感染草魚魚種的潛伏期和前驅(qū)期，魚體紅血球、血漿總蛋白、血和尿素氮明顯減少，病魚乳酸脫氫酶同功酶（lactate dehydrogenase isoenzyme，LDHI）紊 亂。在某些感染魚中，甚至?xí)霈F(xiàn)LDHI多出一條區(qū)帶的現(xiàn)象。在出血病流行期間，血液指標(biāo)存在血清鉀含量增加，鈣含量減少，病魚白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞百分率降低，單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞百分率增高等現(xiàn)象；各臟器小血管內(nèi)皮廣泛受損，引起彌散性血管內(nèi)凝血并形成微血栓，耗去大量凝血因子，引起出血，使循環(huán)血量大為減少，微血栓形成和血液淤帶，阻閉了局部的微循環(huán)，使正常代謝發(fā)生障礙，從而導(dǎo)致臟器組織病變。

表3 不同基因型毒株在不同細(xì)胞系中的培養(yǎng)特性Table 3 The culture characteristics of different viral strains in different cell lines

郭帥等［23］對(duì)草魚呼腸孤病毒的致病機(jī)理進(jìn)行了詳細(xì)的研究報(bào)道，GCRV進(jìn)入細(xì)胞和其他病毒一樣，總體分為四步：首先，病毒的進(jìn)入，病毒核酸和蛋白質(zhì)的合成，病毒粒子的組裝和病毒的釋放。第一步，在病毒進(jìn)入細(xì)胞階段主要靠VP5和VP7等外衣殼蛋白發(fā)揮作用，VP7決定病毒與細(xì)胞的吸附，VP5酶解產(chǎn)生N-端小片段具有在膜上穿孔的功能，協(xié)助病毒進(jìn)入細(xì)胞。第二步，在病毒核酸和蛋白質(zhì)合成階段VP1和VP2發(fā)揮作用，GCRV自身攜帶的RNA聚合酶VP2合成mRNA，其合成過程中5個(gè)VP1形成一個(gè)圓柱形五聚體，跨越內(nèi)外2層核衣殼，方便mRNA合成過程中的轉(zhuǎn)移。第三步，在病毒粒子組裝過程中VP3、VP4、VP6、NS38和NS80發(fā)揮作用，NS80結(jié)合VP3和NS38共同作用形成病毒加工廠——包涵體，內(nèi)層衣殼由120個(gè)VP3構(gòu)成，它可結(jié)合病毒基因組和RNA多聚酶，具有NTPase酶和解螺旋酶活性，能綁定dsRNA；通常GCRV在形成包涵體后的前30min只組裝內(nèi)層衣殼，后30min組裝外層衣殼；在病毒擴(kuò)增過程中VP4和VP6起輔助作用。第四步，NS31在病毒釋放過程中起重要作用，NS31編碼一個(gè)跨膜蛋白，引起膜通透性增加和膜融合，新合成的病毒粒子得以從細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞外。

6 草魚呼腸孤病毒分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

關(guān)于GCRV的檢測(cè)，電鏡觀察是最直觀有效的方法，所以在最初的研究中應(yīng)用較多，但是存在著技術(shù)和儀器要求復(fù)雜、樣品制備較麻煩等問題。隨著現(xiàn)代免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)在魚類病毒病檢測(cè)和疾病診斷中的應(yīng)用，使GCRV的檢測(cè)變得日益簡(jiǎn)便和快速。王鐵輝等應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription PCR，RT-PCR）技術(shù)成功地?cái)U(kuò)增了GCRV-861基因組的特異節(jié)段，建立了快速檢測(cè)GCRV的新方法。應(yīng)用該技術(shù)對(duì)純化的GCRV核酸進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，最小檢測(cè)量可達(dá)0.1pg病毒核酸。對(duì)人工感染GCRV-861毒株的草魚病料進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，不僅能檢測(cè)到發(fā)病期顯癥病魚存在GCRV，還能檢測(cè)發(fā)病前期及愈后病毒攜帶者中存在GCRV；該法還能檢測(cè)自然發(fā)病魚及染毒細(xì)胞中的GCRV。RT-PCR技術(shù)是目前檢測(cè)GCRV最為靈敏而特異的方法，對(duì)草魚出血病的早期診斷和預(yù)防，及抗病育種都具有重要意義。之后，針對(duì)不同毒株，不同檢測(cè)目的，先后改進(jìn)和建立了多種用于GCRV檢測(cè)的RT-PCR技術(shù)，王曉豐等［24］、王 菁 等［25］、張 蘭 蘭 等［4］都 相 繼 建 立 了 RTPCR檢測(cè)GCRV的方法。

由于GCRV有許多不同毒株，它們之間的基因型也有很大差異，為方便快捷的檢測(cè)并鑒定不同類型的毒株，多重RT-PCR應(yīng)運(yùn)而生。遲妍妍等［26］建立了雙重PCR檢測(cè)GCRV和GCRV-GD108的方法。曾偉偉等［14］把已發(fā)現(xiàn)的GCRV株型分為Ⅰ 、Ⅱ和Ⅲ3個(gè)類型，針對(duì)這3個(gè)類型的GCRV建立了三重PCR檢測(cè)方法，該方法具有較高的敏感性，在較短時(shí)間內(nèi)可一次性完成GCRV鑒定工作，該方法適用于GCRV的快速診斷和草魚出血病分子流行病學(xué)調(diào)查。

由于常規(guī)的電鏡技術(shù)、常規(guī)RT-PCR和多重RT-PCR只能進(jìn)行定性檢測(cè)，而不能定量，但是在研究GCRV過程中不僅需要定性描述，而且需要定量分析，因此熒光定量PCR技術(shù)也相繼發(fā)展起來。周勇等［27］建立了靈敏度高，特異性強(qiáng)的檢測(cè)GCRV的 TaqMan real-time PCR 法。劉寶芹等［12，21］針對(duì)GCRV-HZ08和GVRV-JX0901分別建立了快速、靈敏、特異的FQ-PCR檢測(cè)方法。安偉等［28］也建立了熒光定量PCR方法。熒光定量PCR的建立對(duì)對(duì)草魚出血病在實(shí)驗(yàn)室快速診斷和病毒定量分析具有重要意義。

不管是電鏡技術(shù)還是PCR技術(shù)，都需要復(fù)雜的操作過程和精密的儀器設(shè)備，適合在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，并且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。草魚出血病危害巨大，造成很大經(jīng)濟(jì)損失，因此及早發(fā)現(xiàn)、及早防控有助于減少經(jīng)濟(jì)損失。鑒于此，李玉平等［29］和王曉豐等［30］等建立了RT-LAMP技術(shù)用于檢測(cè)GCRV，該方法設(shè)備要求簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便、快捷，特異性強(qiáng)，敏感性高，非常適合野外檢測(cè)工作，但是該方法假陽(yáng)性率比較高，結(jié)果不可靠，實(shí)際應(yīng)用還有待改進(jìn)。

上述GCRV分子生物學(xué)檢測(cè)方法各有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，需要根據(jù)不同的場(chǎng)合、條件等選擇使用其中的一種或者多種方法。此外，需要對(duì)已有的檢測(cè)方法進(jìn)行改進(jìn)或者研制新的檢測(cè)方法，使其更簡(jiǎn)便化、快速化和準(zhǔn)確化。

7 展望

過去數(shù)年在草魚呼腸孤病毒的基本病原學(xué)特性、毒株的分離與鑒定、細(xì)胞系的建立和細(xì)胞培養(yǎng)特性研究、基因組序列分析、蛋白功能研究、分子生物學(xué)檢測(cè)方法等各方面研究取得了一些進(jìn)展，但是關(guān)于該病毒的傳播途徑與致病機(jī)理、強(qiáng)弱毒株之間在基因水平的差異、基因分型和血清學(xué)分型、流行情況、有效的疫苗和合適免疫途徑等各方面的研究進(jìn)展較為緩慢。

由于GCRV的抗原性都較差，而且不同的試驗(yàn)方法得出的結(jié)論差異較大，使得該類病毒至今尚未建立標(biāo)準(zhǔn)血清型；也由于基因組序列信息的缺乏，GCRV至今也沒有進(jìn)行系統(tǒng)的基因分型。因此，對(duì)不同GCRV毒株進(jìn)行全基因組序列分析，基于豐富的全基因組序列特征等信息，提出GCRV基因分型方法和進(jìn)行基因分型是今后研究的方向之一。GCRV是分節(jié)段的RNA病毒，具有高度的變異性，各種強(qiáng)毒株、弱毒株和變異株在我國(guó)并存；不同地區(qū)的GCRV流行株存在較大差異，不能產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)；目前使用的細(xì)胞滅活疫苗和弱毒疫苗的毒株均是幾十年前分離到的毒株，可能和現(xiàn)在的流行株已有較大的差異。要想有效的預(yù)防和控制草魚出血病，必須深入了解GCRV的遺傳變異規(guī)律和傳播機(jī)制，開展草魚出血病的分子流行病學(xué)調(diào)查，弄清不同地區(qū)GCRV的流行病學(xué)特點(diǎn)。并基于流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，研制適合的新型疫苗。草魚出血病為一種危害嚴(yán)重的暴發(fā)性疾病，變異快和流行廣是導(dǎo)致其暴發(fā)的直接原因，明確GCRV的傳播途徑和感染機(jī)制，切斷其傳播途徑和減少其感染機(jī)會(huì)是從源頭上控制草魚出血病暴發(fā)的有效手段，這也將是今后GCRV研究的重點(diǎn)方向之一。

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