牟 亞，張 郁，西格基，聶艷如，陳朝喜＊

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041；2.黑水縣畜牧獸醫(yī)局，四川阿壩623500）

抗生素在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益等方面發(fā)揮了重要作用，然而由于其廣泛應(yīng)用尤其是不合理使用和濫用導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性并帶來(lái)了很多新的問(wèn)題［1］。世界衛(wèi)生組織（WHO）提出2012年將重點(diǎn)控制抗生素耐藥性問(wèn)題，因?yàn)榭缭絼?dòng)物、人和生態(tài)系統(tǒng)的疾病很多，60%對(duì)人構(gòu)成危險(xiǎn)的病原體來(lái)源于動(dòng)物，并且可能引起人和動(dòng)物發(fā)生嚴(yán)重的公共衛(wèi)生事件，因此迫切需要加強(qiáng)和改善公共健康與動(dòng)物健康系統(tǒng)之間的關(guān)系［2］。相關(guān)研究表明，由于中藥的特殊性，細(xì)菌對(duì)中藥尤其是中藥復(fù)合制劑不易產(chǎn)生耐藥性［3］。

烏樟（Berberis julianae Schneid）又稱(chēng)香樟，在我國(guó)主要分布于長(zhǎng)江以南及西南地區(qū)，尤其以四川省宜賓地區(qū)生長(zhǎng)面積最廣。除了具有凈化有毒空氣能力和用作建筑材料外，其含有的松油二環(huán)烴、樟腦烯、檸檬烴、丁香油酚等化學(xué)物質(zhì)具有抗癌、防蟲(chóng)和治療腹痛和皮膚瘙癢等功效［4-5］。

蠔豬刺（Cinnamomum camphora （L.）Presl）屬小檗堿科，主要分布我國(guó)湖北、四川、貴州、湖南、廣西等省份，其中四川涼山州地區(qū)有十幾種，在四川涼山和貴州省民間常用燒傷、腹瀉等濕熱疾病的治療驗(yàn)方［6-7］。

本文旨在初步探討蠔豬刺和烏樟及其與常用抗菌藥物的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)禽源沙門(mén)菌及大腸埃希菌的體外抗菌作用，以期探究其對(duì)兩種常見(jiàn)的禽類(lèi)病原菌的抑制或殺滅效果，并分析其延緩細(xì)菌抗生素產(chǎn)生耐藥性的原因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 蠔豬刺采自四川省巴中市南江縣的叢林中；烏樟采自湖北省利川市市區(qū)的綠化帶；抗菌藥物（大觀(guān)霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、林可霉素和替米考星）購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，所有抗菌藥物臨用前配成5 120μg／mL的母液備用。

1.1.2 菌株 大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922由西南民族大學(xué)獸醫(yī)藥理學(xué)教研室保存。試驗(yàn)中所用的沙門(mén)菌和大腸埃希菌采自四川省成都市洛帶古鎮(zhèn)某養(yǎng)殖場(chǎng)的跑山雞糞便，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離純化得到純化菌株。

1.2 方法

1.2.1 蠔豬刺和烏樟水提物的制備 分別將采集的蠔豬刺和烏樟樣品適當(dāng)清洗，除去表面的污漬和泥沙，剪成約2cm長(zhǎng)短的小段后37℃烘干后備用。取烏樟干品1kg，蒸餾水浸泡2h后煮沸，文火煎煮30min，反復(fù)3次，最后濾出煎液，合并3次煎煮液后濃縮定容至1 000mL，使水提物相當(dāng)于干物質(zhì)含量為1g／mL，121℃高溫滅菌20min后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。在蠔豬刺水提物的制備過(guò)程中其煎煮步驟同烏樟，取蠔豬刺4.0kg，最后定容至1 000 mL，使水提物相當(dāng)于干物質(zhì)含量為4g／mL，121℃高壓滅菌20min后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌懸液的制備 將標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922和純化后的禽源大腸埃希菌和沙門(mén)菌的菌種經(jīng)LB肉湯增殖24h后，制成含菌數(shù)約為105cfu／mL～106cfu／mL的菌懸液。

1.2.3 MIC和FIC測(cè)定 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）推薦的微量肉湯稀釋法對(duì)蠔豬刺和烏樟水提物及大觀(guān)霉素等抗菌藥物進(jìn)行最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）的測(cè)定。

1.2.3.1 最小抑菌濃度測(cè)定 具體操作步驟如下：96孔細(xì)胞培養(yǎng)板前11列各孔加100μL MH肉湯，然后分別在第1、2列的第1孔加入100μL藥物A，依次倍比稀釋至第11列，第1、2列的前11孔各加入100μL制備好的菌懸液。同樣，在第3、4列加入100μL藥物B，依次倍比稀釋至第11列，最后第3、4列的前11孔各加入100μL制備好的菌懸液。37℃培養(yǎng)16h～24h后，計(jì)算MIC。臨床共分離到的11株大腸埃希菌和16株沙門(mén)菌，每個(gè)菌株對(duì)每個(gè)藥物做兩個(gè)重復(fù)。

1.2.3.2 聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 棋盤(pán)稀釋法進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的步驟如下：96孔細(xì)胞板的前8列各孔加入100μL MH肉湯，在第1列各孔加100μL藥物A，依次倍比稀釋至第8列，最后吸出100μL加入第9列，同樣在第一行前8孔各加100μL藥物B，依次倍比稀釋至第8行，最后在前10列各孔加入100μL制備好的菌懸液，37℃培養(yǎng)16h～24h后，計(jì)算FIC。因大觀(guān)霉素、環(huán)丙沙星對(duì)沙門(mén)菌、大腸埃希菌、標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC25922的MIC值均為該藥的最小稀釋濃度，故聯(lián)合藥敏試驗(yàn)只做其余的藥物。此外，聯(lián)合藥敏試驗(yàn)只做標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC25922。

2 結(jié)果

蠔豬刺、烏樟和抗菌藥物對(duì)沙門(mén)菌和大腸埃希菌的MIC范圍、MIC50和MIC90如表1所示，從中可以看出，蠔豬刺和烏樟對(duì)沙門(mén)菌和大腸埃希菌的最小抑菌濃度均為1g／mL，其他抗菌藥物對(duì)沙門(mén)菌和大腸埃希菌的最小抑菌濃度在NCCLS提供的質(zhì)控范圍內(nèi)。

雖然蠔豬刺和烏樟對(duì)大腸埃希菌的最小抑菌濃度一樣，但當(dāng)兩種中藥分別與抗菌藥物及另一種中藥聯(lián)合用藥時(shí)，表現(xiàn)出不同的抗菌作用。從表2可以看出，蠔豬刺-紅霉素、烏樟-紅霉素、烏樟-替米考星、烏樟-林可霉素聯(lián)合應(yīng)用表現(xiàn)為相加作用；蠔豬刺-林可霉素，烏樟-蠔豬刺聯(lián)合應(yīng)用表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用；蠔豬刺-替米考星聯(lián)合應(yīng)用表現(xiàn)出無(wú)關(guān)作用。

表1 蠔豬刺、烏樟和抗菌藥物對(duì)沙門(mén)菌和大腸埃希菌的MIC范圍、MIC50和MIC90Table 1 MIC range，MIC50and MIC90of E.coli and Salmonellato Berberis julianae，Cinnamomum camphora and antimicrobials

表2 蠔豬刺、烏樟水提物和抗菌藥物聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Combined antimicrobial susceptibility test results of Berberis julianae，Cinnamomum camphora and antimicrobials

3 討論

3.1 煎煮過(guò)程對(duì)烏樟和蠔豬刺有效成分的影響

在煎煮過(guò)程中，烏樟和蠔豬刺中某些有效成分可能會(huì)有不同程度的損失，導(dǎo)致藥物抑菌能力與抗生素相比不是十分理想，其主要原因是藥物的有效成分不溶于水或者藥物的有效成分性質(zhì)不穩(wěn)定，在遇到熱源時(shí)易遭到破壞，導(dǎo)致其抑菌能力差，從而對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成一定影響，因此如何排除煎煮過(guò)程中各因素對(duì)中藥抑菌效果的發(fā)揮至關(guān)重要。

3.2 水提法提取烏樟和蠔豬刺優(yōu)缺點(diǎn)分析

水提法較其他提取方法具有設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、操作簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)，尤其是中藥提取物往往是多種成分的混合物，抑菌效果可能是各種成分共同發(fā)揮作用的結(jié)果，因此水提法廣泛應(yīng)用于植物藥材有效成分的初步提取。在本試驗(yàn)的預(yù)試驗(yàn)中，采用水提法對(duì)烏樟和蠔豬刺根、莖和葉子等不同部位分別進(jìn)行提取比較，其抑菌效果相差不大，在一定程度上可以保證試驗(yàn)的順利進(jìn)行。

3.3 中草藥飼料添加劑在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用

大量試驗(yàn)證實(shí)，中草藥中含有蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、酯類(lèi)、維生素、微量元素、鞣質(zhì)、色素、皂苷等物質(zhì)［9-11］，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、預(yù)防和治療畜禽疾病、增進(jìn)機(jī)體新陳代謝能力、促進(jìn)蛋白質(zhì)和酶的合成以及提高動(dòng)物生產(chǎn)性能等多重功效［12-13］。針對(duì)烏樟和蠔豬刺分布區(qū)域比較廣和采集方便等優(yōu)點(diǎn)，我們?cè)O(shè)想是否可以考慮將蠔豬刺和烏樟作為中草藥飼料添加劑，充分發(fā)揮其無(wú)毒、無(wú)害、低殘留且不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn)，還可大大增強(qiáng)家禽的免疫力，達(dá)到預(yù)防疾病的目的。因此，在下一步的試驗(yàn)中將繼續(xù)研究其體內(nèi)抑菌效果以及其對(duì)細(xì)菌性感染疾病的防治，從而為其后續(xù)研究奠定一定基礎(chǔ)。

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