張成福

（西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850009）

牦牛（Bos grunniens）是分布于以青藏高原為中心，及其毗鄰的高山、亞高山地區(qū)的特有牛種［1］，是“世界屋脊”著名的景觀牛種，藏語叫雅克，國外通稱為yak［2］。牦牛具有耐高寒、耐粗飼、抗逆性強(qiáng)、乳脂率高、肉質(zhì)好，毛絨品質(zhì)優(yōu)等特性，為高原人民提供著乳、肉、皮、毛、絨、役、燃料等生活必需品。牦牛的生長繁殖情況直接決定著牦牛養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)收入和生活水平。全世界現(xiàn)有牦牛近1 500多萬頭，在牛家族中僅占1%［3］，其中中國的牦牛數(shù)量最多，有1 400多萬頭，占世界牦牛總數(shù)的95%以上［4］，而西藏是我國第二大牦牛產(chǎn)區(qū)，有牦牛490多萬頭［5］，占我國牦?？倲?shù)的35%。隨著胚胎生物技術(shù)的延伸以及發(fā)育生物學(xué)研究的不斷深入，超數(shù)排卵、胚胎移植技術(shù)為加快育種步伐，純種擴(kuò)群提供了有力的技術(shù)支持。

超數(shù)排卵技術(shù)是胚胎移植中最基本而重要的技術(shù)之一［6］。超數(shù)排卵（superovulation）簡稱超排，在母畜發(fā)情周期中的適當(dāng)時間注射促性腺激素，使卵巢上有比自然狀態(tài)下更多的卵泡發(fā)育并排卵［7］。Smith和 Engle（1927）首先發(fā)現(xiàn)超排現(xiàn)象［8］，Cole和Hart（1930）發(fā)現(xiàn)孕馬血清可使未成熟的大鼠超排［9］，以此奠定了超排的基礎(chǔ)。Casida等在1940年就開始了試驗牛的超數(shù)排卵，后來Graves等又作了進(jìn)一步的改進(jìn)［10］。目前大量使用的超排程序是20世紀(jì)80年代初成型并推廣使用的。供體牛的超數(shù)排卵是獲得胚胎的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其效率的高低是制約胚胎移植技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵因素，超排效率的高低直接影響胚胎的生產(chǎn)數(shù)量和胚胎的生產(chǎn)成本，提高供體牛的超數(shù)排卵效率是胚胎移植技術(shù)推廣過程中需要解決的關(guān)鍵問題，也是降低胚胎生產(chǎn)成本的有效途徑。本人在查閱大量相關(guān)文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上，就牦牛超數(shù)排卵技術(shù)研究的最新進(jìn)展進(jìn)行一下概括性的論述，以供大家商榷。

1 超數(shù)排卵的機(jī)理

動物在出生前卵巢內(nèi)就含育大量的原始卵泡，但出生后隨著年齡的增長，數(shù)量不斷減少，在發(fā)育過程中大多數(shù)卵泡中途閉鎖而死亡，只有少數(shù)卵泡才能發(fā)育成熟而排卵。超數(shù)排卵的過程就是應(yīng)用超過體內(nèi)正常水平的外源促卵泡激素，使將要閉鎖的有腔卵泡發(fā)育成熟而排卵［11］。排卵前，卵泡經(jīng)歷著三大變化：①卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核成熟；②卵丘細(xì)胞聚合力松解，顆粒細(xì)胞各自分離；③卵泡腆變薄、破裂。所有這些變化都是由于LH和FSH的釋放量驟增，并達(dá)到一定比例時引起。

1.1 排卵的生物化學(xué)機(jī)制

各種動物血漿中LH的水平在卵泡早期比較平穩(wěn)，到達(dá)中期稍有升高，于排卵之前達(dá)到最高峰值。LH峰值出現(xiàn)可以激發(fā)卵泡膜中腺苷化酶的活性，導(dǎo)致cAMP增加，由此引起顆粒細(xì)胞黃體化，使卵泡內(nèi)孕酮增加，并激活卵泡中蛋白質(zhì)分解酵、膠原酶等，這些酶作用于卵泡壁的膠原結(jié)構(gòu)，使其張力下降，膨脹性增加，最后引起排卵。試驗表明，LH可以使卵巢上的卵泡全部破裂，但只有配合FSH使用時才能排出成熟的卵子。FSH和LH的最小排卵劑量分別是50μg和5μg，如單獨(dú)注射LH 10μg或更多些，即可能注射后10h半內(nèi)排卵，但如劑量少于10μg則卵泡就不發(fā)生排卵而黃體化。如單獨(dú)注射FSH 100μg，則注射后10h半內(nèi)排卵，如少于100 μg，則不排卵，也不黃體化。這充分說明LH 和FSH兩者的協(xié)同作用。因此，有人假定LH和FSH混合物稱為誘發(fā)排卵激素（Ovulation inducing hormone，OIH）。此外，孕酮、PGE2及PGF2α等激素也對排卵起重要作用。如上所述，在排卵過程中卵泡外膜發(fā)生水腫致使卵泡膜纖維分解酵增加，使纖維蛋白分解，外膜細(xì)胞的聚合力松解，因而使卵泡外膜分離，這些變化是由于排卵前出現(xiàn)LH峰后，雌二醇含量減少而孕酮含量增加，使雌二醇和孕酮比例驟變引起的。當(dāng)接近排卵時，在促性腺激素的作用下，成熟卵泡的cAMP有明顯增加，刺激前列腺素（PG）合成，于是卵泡中PGE2和PGF2α的濃度顯著升高。PGE2能增強(qiáng)纖維蛋白分解酶原的產(chǎn)生，從而增加纖維蛋白分解酶的活性，使卵泡膜分解破裂，PGE2還可刺激顆粒細(xì)胞合成孕酮及本身黃體化，而PGF2α則能對溶酶體膜起破壞作用，因此，它可促進(jìn)卵泡頂端上皮細(xì)胞溶酶體的破裂，使上皮細(xì)胞脫落，頂端形成排卵點(diǎn)，所有這些都為排卵創(chuàng)造條件。因此，目前多數(shù)報道認(rèn)為，排卵是由于酶的作用。通過電鏡觀察，排卵裂口處的局部溶解是從卵巢表面上皮細(xì)胞開始，細(xì)胞先增大，胞質(zhì)內(nèi)所含各種蛋白分解酶的溶酶體增多，釋放的蛋白分解酶進(jìn)入細(xì)胞外間隙，使下面的白膜，卵泡內(nèi)膜與外膜的結(jié)締組織崩解，致使卵泡壁在酶的作用下發(fā)生溶解。

1.2 排卵的神經(jīng)肌肉機(jī)制

近年研究發(fā)現(xiàn)，在卵泡壁上存在富含自主神經(jīng)末稍的平滑肌細(xì)胞，主要分布在成熟卵泡的外膜細(xì)胞上。在排卵前2～3h，卵巢自發(fā)性的收縮頻率開始增加，在排卵前后達(dá)到高峰。PGF2α具有刺激卵巢平滑肌收縮及使卵巢收縮頻率增加的作用。卵巢的收縮導(dǎo)致頂端變薄的卵泡破裂。同時，PGF2α刺激卵泡膜的神經(jīng)肌肉系統(tǒng)，促進(jìn)卵母細(xì)胞的排出。

2 牦牛超數(shù)排卵常用的幾種激素

牦牛超數(shù)排卵常用的激素主要有三大類：一是刺激卵泡發(fā)育的激素：促卵泡素（FSH）、孕馬血清促性腺激素（PMSG）；二是刺激排卵的激素：促黃體素（LH）、絨毛膜促性腺激素（HCG）；三是輔助激素：前列腺素（PG）、促排卵素3號（LRH－A3）等。

2.1 刺激卵泡發(fā)育的激素

2.1.1 促卵泡素（FSH） 促卵泡素是垂體前葉合成和釋放的一種糖蛋白激素，是垂體前葉促性腺激素之一。對于雌性哺乳動物能夠刺激卵泡細(xì)胞增殖分裂，促使卵泡擴(kuò)展、卵泡生長和成熟，提高顆粒細(xì)胞內(nèi)芳香化酶活性，從而將內(nèi)膜細(xì)胞合成的雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素。

2.1.2 孕馬血清促性腺激素（PMSG） 孕馬血清促性腺激素是馬屬動物在妊娠6～20周、由子宮內(nèi)膜杯狀組織（由絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入母體子宮內(nèi)膜構(gòu)成）合成和分泌的一種糖蛋白激素。云馬血清促性腺激素兼具促卵泡素和促黃體素雙重生物學(xué)作用。

2.2 刺激排卵的激素

2.2.1 促黃體素（LH） 促黃體素是由垂體前葉合成和釋放的一種糖蛋白激素，是垂體前葉促性腺激素之一。對于雌性哺乳類動物能夠激發(fā)卵泡內(nèi)膜細(xì)胞類固醇合成酶系的活性，從而將膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に?，協(xié)同F(xiàn)SH促進(jìn)卵泡的成熟。排卵前LH高峰引起的母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，改變顆粒細(xì)胞的內(nèi)分泌功能，導(dǎo)致排卵并形成黃體。LH還具有維持黃體分泌孕酮的作用。

2.2.2 絨毛膜促性腺激素（HCG） 絨毛膜促性腺激素是人類（或靈長類動物）在妊娠8～22周由胎盤的合胞體滋養(yǎng)層所合成和分泌的一種糖蛋白激素。這種激素具有促黃體素的生物學(xué)作用。

2.3 輔助激素

2.3.1 前列腺素（PG） 前列腺素廣泛存在于多種器官和組織中，一般是就地產(chǎn)生并就地發(fā)揮作用，所以稱為局部激素。PG是一種不飽和脂肪酸的衍生物，種類很多，同生殖機(jī)能關(guān)系密切的主要是E和F兩種類型，而在超數(shù)排卵中常用的是F型。F型前列腺素（PGF）能夠引起功能黃體退化，尤其以前列腺素F2a（PGF2a）的溶黃體作用最為顯著。由未孕子宮角的內(nèi)膜產(chǎn)生，經(jīng)特殊的子宮－卵巢血管系統(tǒng)進(jìn)入同側(cè)卵巢，引起黃體退化。

2.3.2 促排卵素3號（LRH－A3） 促排卵素3號為人工合成的多肽激素，為丘腦下部釋放的促黃體素釋放激素的類似物，兼具有促黃體素和促卵泡素作用。能促使動物垂體前葉釋放促黃體素（LH）和促卵泡素（FSH），使血漿中LH濃度明顯升高（FSH濃度輕度升高）促使卵巢的卵泡成熟而排卵。

3 牦牛超數(shù)排卵方法的研究概況

牦牛的超數(shù)排卵和胚胎移植研究較其它牛種起步較晚，直到本世紀(jì)初才陸續(xù)開始。2002年中國農(nóng)科院蘭州畜牧與獸藥所［12］首次母牦牛沖卵成功，獲得17枚野血牦牛胚胎。同時期，羅曉林［13］曾結(jié)合牦牛雜交改良（利用黑白花牛凍精冷配家牦牛）、野牦牛馴化及人工采精、野牦牛改良復(fù)壯家牦牛、牦牛體外受技精術(shù)的研究，闡述了動物生物技術(shù)在牦牛的人工授精、誘導(dǎo)發(fā)情、同期發(fā)情、超數(shù)排卵、胚胎移植、體外受精等方面的應(yīng)用與發(fā)展。截至目前，對牦牛超數(shù)排卵方法的研究大致有兩大類，即單一激素超排和不同外源激素組合超排。

3.1 單一激素超排

此法常用FSH超排，即在牦牛發(fā)情周期（發(fā)情當(dāng)天計為0天）的9～13d中的任意一天開始肌肉注射FSH，以遞減劑量的方式連續(xù)注射4d，每天注射2次（間隔12h），總劑量為8.0～9.0mg，不同體重、胎次的母牦?？蛇m當(dāng)調(diào)整劑量。2004年權(quán)凱［14］采用氯前列烯醇開展母牦牛同期發(fā)情，首次在發(fā)情后第9～11d采用遞減法注射總劑量為8.8mg促卵泡素（FSH，中科院動物所生產(chǎn)）進(jìn)行超數(shù)排卵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)平均每頭回收的胚胎數(shù)和可利用胚數(shù)分別為5.7枚和4.0枚，與普通牛的超數(shù)排卵效果相似。而閻萍等［15］進(jìn)行的高寒放牧條件下牦牛超排試驗結(jié)果表面：A 組：FSH8.14mg，母牦牛與正常發(fā)育相似，沖出2枚發(fā)育正常囊胚，1頭放棄；B組：FSH8.16mg，利用PVP包埋1次注射，母牦牛卵巢處于靜止?fàn)顩r，插管1頭，沒有沖出胚胎，超排處理無結(jié)果。說明牦牛用FSH 8.14～8.16mg劑量偏小，對超排無效果。

3.2 不同外源激素組合超排

近年來，隨著胚胎移植技術(shù)的逐漸成熟、完善和對一些常用超排激素的功能的進(jìn)一步認(rèn)知了解，研究者們在常用超排激素的組合使用方面進(jìn)行了大量的研究，并取得了較好的效果。李全等［16］在高原放牧條件下，對6頭環(huán)湖型牦牛進(jìn)行了不同外源激素組合處理的超數(shù)排卵試驗，結(jié)果表明：試驗A組（FSH＋PG＋HCG）和試驗B組（FSH＋PG）供體牛對國產(chǎn)激素超排處理都有反應(yīng)。試驗A組獲黃體數(shù)超過20個，回收胚胎14枚，其中可用胚胎11枚，4～16細(xì)胞胚胎3枚；試驗B組獲黃體數(shù)20個，回收1枚可用胚胎，為B級囊胚。閻萍等［15］進(jìn)行的高寒放牧條件下牦牛超排試驗結(jié)果表面：FSH 8.18 mg，分FSH ＋ LH（200IU）、FSH ＋HCG（1 000 IU）進(jìn)行超排，獲14枚胚胎，有1頭牦牛沖出10枚胚胎，其中有2枚發(fā)育到16細(xì)胞，1枚發(fā)育到32細(xì)胞，說明FSH＋ HCG（LH）有協(xié)同作用，促進(jìn)卵巢上卵母細(xì)胞成熟和排卵。姬秋梅等［17］2005年用PGF2a＋FSH連續(xù)遞減法對西藏當(dāng)雄10頭5～10歲供體母牦牛實施了超數(shù)排卵試驗，結(jié)果為：10頭供體牛共獲得7枚胚胎，PGF2a＋FSH連續(xù)遞減法超排效果較好。樊江峰等［18］對12頭健康成年天祝母白牦牛采用CIDR＋FSH＋PG的超數(shù)排卵處理，并運(yùn)用超聲探測技術(shù)對超排過程中卵巢的變化情況做了全程監(jiān)測。結(jié)果表明：在處理的12頭牛中有5頭監(jiān)測到明顯的卵泡閉鎖現(xiàn)象。

4 結(jié)語

盡管近年來牦牛超數(shù)排卵技術(shù)發(fā)展迅速，并取得了很大的進(jìn)步，但是超排是一個復(fù)雜的生理過程，受很多因素的影響，要使供體的超排處理得到人們所期望的效果是極不容易的。因此，隨著胚胎生物工程和基因工程的不斷發(fā)展，牦牛個體對超排處理的不同反應(yīng)與遺傳特性、年齡、營養(yǎng)狀態(tài)、季節(jié)、開始超排日期、激素制劑中FSH／LH比例、給藥途徑、劑量和頻率等因素的相關(guān)性都需進(jìn)一步研究。

［1］ 鐘金城.牦牛遺傳與育種［M］.成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，1996.

［2］ 牛春娥，張利平，孫俊峰，等.我國牦牛資源現(xiàn)狀及其產(chǎn)品開發(fā)利用前景分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（17）：8003－8005.

［3］ 孫海梅.入世與我國的牦牛業(yè)［J］.國際貿(mào)易問題，2002，（5）：16－18.

［4］ 中國畜禽遺傳資源狀況編委會.中國畜禽遺傳資源狀況［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004：18.

［5］ 方毅才.我國牦牛發(fā)展現(xiàn)狀與前景分析［J］.農(nóng)業(yè)科技與信息，2009，（19）：14－15.

［6］ 和占星，松崎伸生，市野清博，等.不同超排處理的效果及可用胚數(shù)的影響因素分析［J］.黃牛雜志，2000，26（5）：12－15.

［7］ 俞頌東，王友明，余東游.影響家畜超排效果因素和幾種超排方法［J］.草食家畜，2002，（1）：29－32.

［8］ 孫玉成，張建芳，孟令君，等.影響小鼠超排效果的因素［J］.北京農(nóng)業(yè)學(xué)報，2005，12（4）：17－19.

［9］ 徐小波，王公金，趙 偉，等.山羊胚胎移植技術(shù)研究進(jìn)展［J］.畜禽業(yè)，2005，（3）：44－47.

［10］ 房 義，李樹靜，余文莉，等.影響家畜超數(shù)排卵效果的研究進(jìn)展［J］.黑龍江動物繁殖，2006，14（2）：20－22.

［11］ 北京農(nóng)業(yè)大學(xué).家畜繁殖學(xué)［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1991.

［12］ 陸仲磷，閻 萍，王槐田.中國牦牛科學(xué)技術(shù)發(fā)展回顧與展望［J］.中國草食動物，2003，23（3）：33－36.

［13］ 李彥欣.異種克隆牦牛羚牛及相關(guān)機(jī)理的研究［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2004.

［14］ 權(quán) 凱.牦牛超數(shù)排卵技術(shù)研究［D］.甘肅蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文，2004.

［15］ 閻 萍，梁春年，姚 軍，等.高寒放牧條件下牦牛超排試驗［J］.中國草食動物，2003，23（3）：9－10.

［16］ 李 全，劉書杰，柴沙駝，等.青藏高原牦牛超數(shù)排卵試驗［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008，（1）：11－13.

［17］ 姬秋梅，達(dá)娃央拉，馬曉寧，等.西藏當(dāng)雄牦牛超數(shù)排卵及胚胎移植試驗［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2007，34（9）：133－135.

［18］ 樊江峰，王世雷，李天強(qiáng)，等.天祝白牦牛超排過程中卵泡閉鎖的初步研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（20）：8612－8614.