魏必 潘珊珊

上海體育學院運動科學學院（上海200438）

短時間內(nèi)對心肌進行一次或反復多次的缺血再灌注，可增加心肌保護物質(zhì)的表達，減輕心肌組織的缺血再灌注損傷，誘導強大的內(nèi)源性保護作用，這一過程被稱為缺血預適應 （ischemicpreconditioning，IP）［1］。IP的發(fā)現(xiàn)為臨床心血管疾病的治療提供了新的思路，雖在臨床應用上仍存在局限，但預適應的理念得到了很好的擴展。首先，預適應的方式得到豐富，從最初冠狀動脈結(jié)扎發(fā)展到藥物刺激、肢體結(jié)扎、溫度、低氧、運動等，出現(xiàn)了藥物預適應、溫度預適應、低氧預適應、運動預適應等新型預適應；其次，基礎研究手段推陳出新，從藥物阻斷、離體灌注到細胞培養(yǎng)、基因敲除等，明確了預適應相關物質(zhì)的生物學作用；第三，研究思路不斷開拓，從對心臟的器官水平研究發(fā)展到心臟與各器官及四肢的系統(tǒng)水平研究，即遠程預適應，預適應的時間也從缺血再灌注（I/R）前擴展到I/R后，即缺血后適應。其中，運動預適應（exercise preconditioning，EP）是短時間內(nèi)通過一次持續(xù)或反復多次間歇的大強度運動，造成心肌相對或絕對的缺血缺氧，從而增加保護效應物質(zhì)表達，提高心肌組織對隨后長時間缺血的耐受，減輕缺血再灌注損傷，誘導心肌保護作用［2］。EP作為一種獨特的預適應方式，在充分調(diào)動人體各系統(tǒng)功能的前提下，發(fā)揮心肌保護作用，具有創(chuàng)傷性小、簡便易行、強度可控的特點。

EP與IP所涉及的物質(zhì)，根據(jù)其在信號轉(zhuǎn)導途徑中的作用，可初步分為觸發(fā)物質(zhì)、中介物質(zhì)和效應物質(zhì)三類。蛋白激酶C（proteinkinaseC，PKC）作為IP和EP心肌保護效應的中介物質(zhì)，發(fā)揮著重要的生物學作用，且主要涉及α、δ、ε三個PKC亞型。目前相關研究認為：δPKC主要介導心肌損傷，但其激活是發(fā)揮EP保護作用的前提［32-36］；εPKC主要通過改善細胞能量供應、維持細胞離子平衡、增加效應物質(zhì)表達，介導EP保護效應［38-40］；αPKC的功能尚存爭議：部分學者認為［24-27］αPKC可增加效應物質(zhì)表達，介導心肌保護，而另一部分學者［21］認為αPKC在EP心肌保護效應中作用較小，主要在心肌肥大和心衰過程中發(fā)揮作用。本文通過對EP保護效應中PKC亞型的相關研究進行總結(jié)，并結(jié)合IP心肌保護效應中PKC亞型的相關研究，為今后EP心肌保護效應中PKC的研究提供一些參考和思路，有利于更好地明確EP過程中α、δ、εPKC的生物學功能及α、δ、εPKC各亞型間關系。

1 PKC的生物學特征

1.1PKC的分類

PKC是一種廣泛分布于人體的絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）激酶，可通過磷酸化多種蛋白質(zhì)的Ser/Thr殘基，調(diào)節(jié)組織細胞的代謝、生長、增殖和分化等過程。 PKC家族共有11個成員，可分為三類［3］：（1）傳統(tǒng)型PKC（conventionalPKC，cPKC）包括α、βI、βII、γ，可被磷脂酰絲氨酸（PS）、Ca2+、二?；视停―AG）或豆蔻酸212佛波醇213乙醇脂 （phorbol212-myristate 213-acetate，PMA）等激活；（2）新型PKC（novelPKC，nPKC）包括δ、ε、η、θ，其不被Ca2+激活，可被DAG和PMA激活；（3）非典型PKC（atypicalPKC，aPKC）包括ζ、λ、τ，其不被Ca2+、DAG或PMA激活，可被脂類衍生的第二信使激活。μPKC，因其結(jié)構與功能，已被歸入蛋白激酶D（proteinkinaseD，PKD）家族。

1.2PKC的信號轉(zhuǎn)導

PKC均為單鏈多肽結(jié)構，N端為調(diào)節(jié)域，C端為催化域，通過絞鏈區(qū)相連。cPKC有4個保守區(qū)（C1~C4）和5個可變區(qū) （V1~V5）。C1區(qū)有PS和DAG的結(jié)合位點，PMA也作用于該域，PKC可通過C1區(qū)前的假底物位點，調(diào)節(jié)自身活性；C2區(qū)為cPKC特有的Ca2+結(jié)合位點；C3、C4區(qū)為ATP和底物的結(jié)合位點。nPKC缺失C2區(qū)，不可被Ca2+激活；aPKC因C1區(qū)部分缺失和C2區(qū)封閉，不可被Ca2+和DAG激活。V3區(qū)連接PKC調(diào)節(jié)域（C1、C2區(qū)）和催化域（C3、C4區(qū)），V3區(qū)暴露時可被蛋白酶水解，使PKC激活。

PKC未激活時溶于胞質(zhì)，當?shù)谝恍攀古cGq蛋白結(jié)合，可激活磷酸酯酶Cβ（phospholipaseCβ，PLC-β）， 從 而 將 膜 上 的 脂 酰 肌 醇4，5-二 磷 酸（phosphatidylinositolbiphosphate，PIP2） 分解為兩個細胞內(nèi)的第二信使：DAG和三磷酸肌醇（IP3），再激活PKC，引起級聯(lián)反應，進行細胞的應答。該通路也稱IP3-DAG-Ca2+信號通路。PKC可增加相關蛋白表達，或通過激活促分裂素活化蛋白激酶 （mitogenactivatedproteinkinases，MAPKs）、 核因子κB （NF-κB）等，發(fā)揮生物學作用。PKC由胞質(zhì)向胞膜或其他部位轉(zhuǎn)移的過程稱為轉(zhuǎn)位（translocation）。

1.3PKC的心臟分布特點

PKC的心臟分布具有種屬特點。在人心室細胞中，通過免疫印跡法檢測到了α、βI、βII、δ、ε、η、ζ、λ、τ共9種PKC亞型［4］；成年大鼠心臟中，主要PKC亞型為ε、δ，其次為η、ζ、τ，cPKC只占一小部分；兔心臟中檢測到除θ外的其他10種PKC亞型，且cPKC含量較nPKC豐富；而犬心臟中主要是ε和ζ兩種PKC亞型［5］。

PKC的心臟表達可隨年齡變化。Takayama等［6］發(fā)現(xiàn)心肌PKC含量可隨年齡改變，成年鼠心臟較新生鼠αPKC有所增加，δPKC有所下降；而老年鼠心臟中αPKC表達更多，δPKC則更少。 Rybin等［7］在胎兒和新生兒心肌組織中發(fā)現(xiàn)α、β、ε和ζPKC的含量較成人高，且隨年齡的增長而降低。

2 EP心肌保護效應及生物學機制

2.1EP的心肌保護效應

長期適度運動對心血管的形態(tài)和功能有積極影響，短時間內(nèi)一次或反復多次間歇大強度運動對心肌同樣具有保護作用。而EP對心肌I/R損傷的保護效應主要表現(xiàn)為：

1.增強心肌組織應激能力。Michaelides等［8］對50位年齡在50~72歲的慢性心絞痛患者進行4次運動，首次運動24h后，再進行其余3次運動，運動不限時，出現(xiàn)危險癥狀時停止。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患者的運動能力有所提高，并提示與胞外超氧化物歧化酶（Ec-SOD）的活性升高有關。彭峰林等［9］對大鼠進行2min速度為16m/min的跑臺運動后，再進行2min速度50 m/min的跑臺運動，坡度5°，重復10次，結(jié)果顯示，EP可顯著降低心肌組織丙二醛（MDA）含量，并顯著提高SOD和GPx的活性，說明EP可有效提升心肌組織抗氧化能力。EP同樣可提升心肌抗急性損傷能力，Shen等［10］對大鼠進行速度28~30m/min、坡度為0、運動10 min休息10min、重復4次的跑臺運動，EP組異丙腎上腺素（ISO）對大鼠心肌的急性損傷作用明顯減輕，且血清心肌肌鈣蛋白I（cardiactroponinI，cTnI）濃度降低，心肌缺血缺氧染色改變較輕。

2.提高血管活性， 縮小梗死面積。Wu等［11］對FVB小鼠在缺血前后分別進行運動，發(fā)現(xiàn)運動可明顯縮小心肌梗死面積，并上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）及其受體Flt-1和Flk-1的表達，增加微血管和毛細血管密度。潘珊珊等［12］讓大鼠運動15min后休息5min，重復4次，發(fā)現(xiàn)EP組大鼠心肌梗死面積較對照組明顯縮小，并發(fā)現(xiàn)降鈣素基因相關肽 （calcitoningenerelated peptide，CGRP）的表達增加，提示其通過影響血管活性，參與EP心肌保護效應，但并未發(fā)現(xiàn)其mRNA水平發(fā)生改變。

3.降低心律失常和心肌頓抑的發(fā)生率。Hamilton等［13］對雄性SD大鼠進行3天、每天60min、速度30m/min、坡度0的跑臺運動后24h，再進行15 min/20min的I/R，發(fā)現(xiàn)運動組心肌梗死面積較對照組明顯縮小，組織中MnSOD活性升高，I/R后心律失常和心肌頓抑的發(fā)生率明顯降低。之后研究認為運動可提高心肌氧化還原能力，降低I/R后心律失常發(fā)生率，但本質(zhì)上與心肌細胞電生理平衡有關，并提示EP可開啟細胞膜敏感鉀通道（sarcoKATP），對調(diào)控細胞電生理有重要作用［14］。

EP有兩個保護效應期，即早期保護效應期（early preconditioning） 和 晚 期 保 護 效 應 期 （delayed preconditioning）。早期保護效應從運動后即刻開始，一般持續(xù)1~3h；晚期保護效應在首次缺血后12~24 h出現(xiàn)，一般持續(xù)48~72h。 Lennon等［15］對大鼠進行5天、速度30m/min、坡度0的跑臺運動，持續(xù)時間從第1天的10min，依次遞增至第5天的50min后，采用同等強度運動3天，每天60min。并在停止運動后第1、3、9、18天進行20min/30min的I/R，結(jié)果顯示，與對照組相比，運動組在停止運動后第1、3、9天的I/R損傷程度依然較輕，但在第18天后無明顯差別。

2.2EP心肌保護效應的生物學機制

IP相關物質(zhì)可根據(jù)細胞信號轉(zhuǎn)導關系大致分為觸發(fā)物質(zhì)、中介物質(zhì)和效應物質(zhì)。作為IP的特殊“延伸”，EP心肌保護效應相關物質(zhì)雖與IP有所不同，但仍可參考IP的思路進行分類：

1.觸發(fā)物質(zhì)：腺苷、腎上腺素激動劑、阿片肽、NO、BK、ROS等。 Capecchi等［16］對患有外周動脈閉塞癥（POAD）的患者進行5次5min大強度跑臺運動，每次EP后休息2h。結(jié)果顯示，EP后患者的無痛跑距和總跑距較之前分別有15.4%和26.9%的提升，且心血管功能明顯提升，并與血漿中腺苷和ATP濃度增加有關。

2.中介物質(zhì)：PKC等。EP可明顯改變心肌PKC亞型的表達，PKC被激活后可向細胞膜、核轉(zhuǎn)位，并通過MAPK和NF-κB通路，增加內(nèi)源性保護物質(zhì)的表達，介導心肌保護。Yamashita等［17］對大鼠進行一次持續(xù)30min、速度23～27m/min、坡度為0的EP，可明顯縮小I/R后的心肌梗死面積，但該保護效應可被PKC抑制劑白屈菜赤堿（chelerythrine，CHE）取消，提示EP心肌保護效應由PKC介導。

3.效應物質(zhì)：ATP敏感鉀通道（KATP）、熱休克蛋白（HSP）、谷胱甘肽（GSH）、SOD等。Demirel等［18］對雌性SD大鼠進行3~5天、每天60min、相當于60~70%VO2max的跑臺運動后發(fā)現(xiàn)，運動組大鼠心肌收縮力明顯提高，并認為與HSP72、GSH和MnSOD的表達增加有關。 French等［19］對雄性SD大鼠進行3天、每天60 min、速度30m/min、坡度0的跑臺運動后，再進行50 min/120min的I/R。結(jié)果顯示，運動組MnSOD及鈣結(jié)合蛋白（L型Ca2+通道、磷脂蛋白和肌漿網(wǎng)ATP酶）的含量和活性均有顯著增加，降低了心肌組織的I/R損傷。運動對心肌的保護作用是通過細胞膜ATP敏感鉀通道 （sarcoKATP） 還是線粒體ATP敏感鉀通道（mitoKATP）實現(xiàn)仍存爭議，但二者均可有效防止細胞內(nèi)Ca2+超載引起的線粒體腫脹［20］。

3 PKC介導EP心肌保護效應

目前PKC介導EP心肌保護效應的研究逐漸增多，大多集中于單純觀察PKC蛋白和基因表達變化對心肌保護的影響。雖對PKC及其上下游物質(zhì)的研究也不少，但δPKC、εPKC與下游效應物質(zhì)的關系研究占很大比例，αPKC的相關研究較缺乏。

3.1 αPKC在EP保護效應中的作用

αPKC作為心肌細胞中主要的cPKC，對Ca2+有強烈的依賴，是心肌細胞生長的調(diào)節(jié)因子，并可改變肌漿網(wǎng)對Ca2+的作用，調(diào)節(jié)蛋白磷脂酶-1（PP-1）活性，降低心肌收縮力。αPKC基因敲除小鼠的心肌收縮力高，αPKC過表達小鼠的心肌收縮力低，且在長期受到外周負荷刺激下產(chǎn)生肥大，甚至心衰［21］。最新研究發(fā)現(xiàn)，鈣超載的干細胞在進行葡萄糖剝奪處理后，可短暫激活αPKC和ERK1/2，是細胞固有促存活機制（intrinsicprosurvivalmechanism）中的一部分，可減輕干細胞的缺血損傷［22］。由此可見，在心肌細胞缺血時，αPKC發(fā)揮著重要作用，但對αPKC在EP心肌保護效應中作用的研究，多停留于其是否發(fā)生轉(zhuǎn)位，而對其下游物質(zhì)及其與δPKC、εPKC的關系研究較少涉及。

EP研究中，Carson等［23］對大鼠進行一次20min、速度23m/min、坡度0的EP后，對αPKC的表達進行觀察，發(fā)現(xiàn)短時間內(nèi)αPKC蛋白表達迅速增加、mRNA水平降低，7天重復運動后αPKC蛋白及mRNA水平持續(xù)性降低，推測可能機制為：一次短暫劇烈運動通過增加αPKC表達，降低心肌收縮能耗，降低代謝產(chǎn)物堆積對細胞的損害；而7天重復運動使αPKC蛋白和mRNA水平降低，可防止細胞內(nèi)Ca2+長期超載，導致心肌病理性肥大及心衰。

而IP研究發(fā)現(xiàn)，αPKC可參與多種效應物質(zhì)的調(diào)控。αPKC可能位于mitoKATP的下游，而εPKC位于mitoKATP的上游。缺血可增加εPKC磷酸化，促進其向線粒體轉(zhuǎn)位，開啟mitoKATP，進一步激活αPKC，通過p38MAPK通路增加效應物質(zhì)表達［24］。 Kitakaze等［25］在對犬進行反復4次5min/5min的I/R后發(fā)現(xiàn)，αPKC向細胞膜轉(zhuǎn)位，可增加胚外5’核苷酸酶的表達，改善心肌在I/R損傷后的能量供應。αPKC向細胞核周轉(zhuǎn)位，與Ca2+調(diào)控和應激信號轉(zhuǎn)導有關［26］。 此外，αPKC在心肌細胞閏盤的強表達提示，αPKC、εPKC和縫隙連接蛋白-43（C-43）可能以復合體的形式發(fā)揮心肌保護作用［27］。

Coaxum等［28］在幼鼠心肌研究中發(fā)現(xiàn)，αPKC過表達可增加HSP70表達，對心肌I/R損傷有保護作用。αPKC和HSP70之間存在一定的交互作用，并不依賴HSF-1的信號轉(zhuǎn)導。Bouwman等［29］發(fā)現(xiàn)七氟醚（Sevoflurane）誘導的心肌保護效應依賴αPKC對ROS的激活，αPKC對I/R后心肌收縮力的改善，并不通過KATP通道的開放實現(xiàn)。還有研究發(fā)現(xiàn)，αPKC對心梗后心肌微血管的再生有一定的作用，白介素1-β通過αPKC/βIPKC與MAPK通路，增強心臟毛細血管內(nèi)皮細胞基質(zhì)中金屬蛋白酶-2（MMP-2）的活性表達，提高梗死后心肌組織的微血管密度［30］。在鼠類干細胞血管發(fā)生的研究中也發(fā)現(xiàn)，VEGF可誘導αPKC、βIIPKC和δPKC的磷酸化，明顯增加血管發(fā)生，而三型PKC的抑制劑可取消這一作用，提示鼠心血管發(fā)育需通過PI3K/PKC通路調(diào)控［31］。

在EP心肌保護效應研究中，關于αPKC激活轉(zhuǎn)位對mitoKATP、5’ 核 苷 酸 酶 、C-43、HSP70、MMP-2 和VEGF表達影響的研究甚少，有待進一步深入研究，這樣才能對EP中αPKC的作用做出更全面準確的評價。

3.2 δPKC在EP保護效應中的作用

δPKC是EP保護效應的第二信使，少量表達δPKC是其他亞型PKC發(fā)揮心肌保護的前提，但過表達δPKC可致心肌壞死和凋亡。一次20min、速度23 m/min、坡度0的EP可增加δPKC磷酸化表達和膜轉(zhuǎn)位；7天重復運動后，δPKC的表達和膜轉(zhuǎn)位又恢復至正常。提示在一次短暫EP后，δPKC以少量表達的形式介導心肌保護。而7天重復運動后，δPKC磷酸化和膜轉(zhuǎn)位水平降低，可防止過表達δPKC引起的心肌損傷［23］。

δPKC主要通過影響線粒體的能量供應，介導心肌I/R損傷。δPKC向線粒體轉(zhuǎn)位，可減弱ADP的呼吸作用，降低三羧酸循環(huán)活性和細胞pH值；抑制26S蛋白酶體活性，導致心肌缺血期ATP水平下降［32］。此外，δPKC可增加心肌細胞ROS產(chǎn)物，促進細胞色素C釋放，誘發(fā)細胞凋亡［33］；通過改變Bad/Bcl-2比率，使二磷腺苷酸核糖多聚酶（PARP）分裂和DNA斷裂［34］；凋亡信號作用于δPKC的調(diào)節(jié)域，使其發(fā)生核轉(zhuǎn)位，并分裂為δCF（催化域片段）啟動細胞凋亡［35］。

δPKC的激活被認為是心肌保護效應發(fā)揮的前提。 研究［36］發(fā)現(xiàn)δPKC的激活可調(diào)控mitoKATP的開放，促進線粒體相關蛋白表達，減輕缺血后線粒體Ca2+超載，改善線粒體功能。但長期低氧環(huán)境下，對成年雄性Wistar大鼠進行7000m/8h/d、5d/w的跑臺運動后，再進行20min/3h的I/R，運動組梗死面積明顯縮小，δPKC的表達顯著增加，而εPKC表達無變化。提示在長期低氧誘導的心肌保護效應中，δPKC發(fā)揮重要作用［37］。

以上關于δPKC的研究多集中于其他預適應，δPKC在EP心肌保護效應中的研究相對缺乏系統(tǒng)性。雖然δPKC在EP中的基礎作用已達成共識，但δPKC涉及的信號轉(zhuǎn)導通路及下游物質(zhì)仍不明確。

3.3 εPKC在EP保護效應中的作用

εPKC作為EP主要的心肌保護亞型，可增強能量代謝激酶活性，改善細胞能量供應；調(diào)控離子通道和縫隙連接蛋白，保持細胞離子平衡；增加終末效應物質(zhì)的表達，保護細胞形態(tài)功能。

一次20min、速度23m/min、坡度0的EP可顯著提高εPKC表達水平；7天重復運動可增加εPKC蛋白及mRNA的表達。一次短暫EP和7天重復運動后，εPKC的表達部位集中在胞質(zhì)，胞膜表達減少，提示εPKC膜轉(zhuǎn)位減少可能與實驗方法或EP晚期保護效應機制有關［23］。 Chicco等［38］對成年SD大鼠連續(xù)進行坡度10°， 速度15m/min、30m/min、15m/min的跑臺運動10min、40min、10min， 運動結(jié)束24h后進行1 h/2h的I/R，結(jié)果雄鼠心梗面積縮小24%，雌鼠心梗面積縮小18%，認為εPKC通過sarcoKATP改善細胞內(nèi)離子狀態(tài)，發(fā)揮心肌保護作用。

εPKC可通過NO相關通路保護心肌。在IP晚期保護效應中，NO激活L型通道，抑制Ca2+的內(nèi)流，降低心肌細胞收縮，拮抗腎上腺素β受體，開啟KATP，增加抗氧化物的含量［39］。而在其他類型運動的心肌保護研究中發(fā)現(xiàn)，NO同樣發(fā)揮著一定作用。也有學者提出，εPKC的適度表達對鼠心臟有保護，但長時間過表達εPKC可使ERK1/2持續(xù)激活，促心臟肥大［40］。

εPKC可通過調(diào)控眾多下游效應物質(zhì)，發(fā)揮心肌保護效應。（1）εPKC可與新陳代謝蛋白、轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白形成復合體，改變葡萄糖代謝相關激酶和線粒體酶的活性， 改善細胞能量供應［41］；（2）εPKC可調(diào)控sarcoKATP和mitoKATP的表達，增加心肌組織中Kir6.2亞基向線粒體的轉(zhuǎn)位， 調(diào)節(jié)細胞內(nèi)離子平衡［42］；（3）εPKC在轉(zhuǎn)基因鼠心肌中過表達，可增加其向線粒體和閏盤的轉(zhuǎn)位，增加VDAC和糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的表達，抑制MPTP在再灌注期間的開放，并增加C-43的磷酸化［43］；（4）εPKC可調(diào)節(jié)鈣離子受體（CaR）的磷酸化，進而調(diào)節(jié)Ca2+從肌漿網(wǎng)向細胞內(nèi)的釋放，防止因Ca2+超載誘發(fā)的細胞損傷［44］。

關于εPKC在IP心肌保護效應中作用的研究眾多，關于其蛋白和基因表達變化及其下游效應物質(zhì)KATP、MPTP、C-43和CaR的研究較系統(tǒng)， 討論也較深入，并認為εPKC可影響能量代謝相關酶活性、改善線粒體功能、維持細胞電生理平衡。而EP的相關研究雖然不少，但缺乏系統(tǒng)性，有待進一步完善。

4 預適應心肌保護效應中PKC亞型間關系

預適應心肌保護效應中，關于PKC亞型間關系的研究較少，且多集中于IP、藥物預適應和低氧預適應等，EP中幾乎未涉及。而EP中關于多型PKC的研究，多為早晚保護效應期PKC亞型蛋白和mRNA表達變化觀察，αPKC、δPKC、εPKC三者間是否存在交互作用及影響彼此磷酸化的可能機制，尚缺乏相關研究和討論。

4.1 αPKC與δPKC的關系

αPKC與δPKC關系的研究集中在調(diào)節(jié)心肌收縮力和心肌凋亡。研究結(jié)果顯示，二者間似乎存在某些潛在通路，在對心肌細胞收縮力的調(diào)控上，發(fā)揮著“相反的作用”，并左右心臟向心衰方向的發(fā)展。Simonis等［45］結(jié)扎成年Wistar大鼠冠狀動脈造成其心肌梗死，觀察梗死后1周，1、2、3個月的心肌恢復情況及PKC亞型的活性。結(jié)果顯示，εPKC表達無明顯變化；αPKC在梗死后1個月表達顯著增加 （157%），之后恢復正常水平；δPKC出現(xiàn)了與αPKC表達相反的趨勢，在梗死后1周和1個月表達水平不變，而梗死后2、3個月表達顯著增加（187%）。這提示在心梗后的心肌重塑過程中，αPKC與δPKC的變化存在一定關系，并認為αPKC表達增加是心衰發(fā)展的征兆，但持續(xù)表達δPKC可致心肌肥大及心力衰竭。

關于IP和Ca2+預適應的研究發(fā)現(xiàn)，αPKC對δPKC的磷酸化作用有一定的影響。Miyawaki等［46］對成年雄性SD大鼠進行5min/10min的IP和5min/10min的高濃度/低濃度Ca2+預適應（HCPC）后，進行一次30 min/40min的I/R。結(jié)果顯示，與對照組比較，IP組和HCPC組梗死面積均明顯縮小，組間無差異。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，αPKC和δPKC均發(fā)生了明顯的膜轉(zhuǎn)位，且αPKC向細胞核轉(zhuǎn)位，可能與晚期保護效應中基因的表達有關，而εPKC無明顯變化。因此，在Ca2+預適應中，Ca2+可直接激活αPKC，并通過DAG間接激活δPKC，αPKC對δPKC磷酸化水平有一定的調(diào)控作用。

在心肌細胞凋亡研究中也發(fā)現(xiàn)，αPKC與δPKC發(fā)揮著“相反的作用”，δPKC促進細胞凋亡，αPKC和βPKC抑制細胞凋亡。δPKC可調(diào)控RACK1和JNK，在促心肌細胞凋亡的同時，還上調(diào)αPKC和βPKC的表達?；蛞种痞腜KC表達后，可取消JNK參與的細胞凋亡；但完全阻斷δPKC后，αPKC和βPKC抑制凋亡作用也取消［47］。

通過以上研究不難看出，αPKC和δPKC在心肌細胞收縮力、心肌細胞凋亡的調(diào)控上，有著相互制約的關系，且彼此影響對方的磷酸化作用，這些作用對于綜合考慮EP心肌保護過程中心肌細胞收縮力和凋亡的調(diào)控機制有著重要意義，但目前EP相關研究尚未涉及。

4.2 αPKC與εPKC的關系

αPKC與εPKC的關系研究較少，且集中于共同調(diào)控心肌保護物質(zhì)的研究。Hassouna等［24］發(fā)現(xiàn)，εPKC位于mitoKATP的上游，而αPKC位于下游。εPKC和αPKC特異性抑制劑均可消除心肌保護效應，但mitoKATP激活劑誘導的保護效應只可被αPKC阻滯劑消除。其可能機制是：缺血應激增加εPKC的線粒體轉(zhuǎn)位，開啟mitoKATP，進一步激活αPKC，通過p38 MAPK增加效應物質(zhì)表達。

而Bowling等［27］還提出εPKC與αPKC共同調(diào)控人心肌組織中C-43磷酸化的可能。在心衰患者左室組織中，αPKC過量表達并大量轉(zhuǎn)移至心肌閏盤。根據(jù)εPKC、αPKC與C-43的關系，認為在人心肌組織中，三者可能以復合體的形式發(fā)揮心肌保護作用。εPKC直接磷酸化C-43，αPKC增加復合體的磷酸化程度。

在EP心肌保護效應中，效應物質(zhì)的重要性毋庸置疑，但關于αPKC與εPKC是否共同影響保護效應物質(zhì)（如mitoKATP、C-43等）有待進一步研究證實，且二者間是否可通過共同的信號通路影響彼此磷酸化水平，目前尚不清楚。

4.3 δPKC與εPKC的關系

隨著近年來預適應研究的不斷深入，多篇IP和EP綜述中均涉及對δPKC和εPKC關系的討論。相關實驗證明，二者之間確實發(fā)揮著近乎相反的作用。δPKC的線粒體轉(zhuǎn)位可致線粒體功能紊亂，加劇細胞損傷，但其激活仍是心肌保護的前提。δPKC的激活為εPKC的激活提供了時間，且ROS的表達增加可進一步激活εPKC。

蛋白酶體（proteasome）的發(fā)現(xiàn)影響了對IP心肌保護機制的認識。IP可通過影響蛋白酶體的活性，調(diào)控δPKC/εPKC的比例關系，降低δPKC的表達，增加εPKC的表達，可降低細胞損傷；反之亦然。且蛋白酶體在再灌注期能激活相關保護激酶，如Akt和ERK1/2等，抑制δPKC對細胞色素C的影響，發(fā)揮心肌保護作用［32］。但目前缺乏EP心肌保護效應中蛋白酶體活性變化的相關研究。

Rybin等［48］對δPKC與εPKC在心肌中磷酸化的關系進行了研究，通過腺病毒使εPKC過表達，可增加δPKC的磷酸化水平。與其他PKC亞型不同，δPKC的激活并不一定需要活化環(huán)（activation loop）即δPKCThr505的激活，而εPKC過表達可增加δPKC-Thr505的自磷酸化，影響δPKC-Tyr311/Tyr332磷酸化過程，調(diào)控δPKC磷酸化的表達。

Duquesnes等［49］對δPKC/εPKC的關系進行過系統(tǒng)綜述。在心臟相關PKC亞型中，二者均涉及心臟肥大和預適應保護效應，εPKC主要促細胞生長、分化、增殖，是重要的癌基因。與之相反，δPKC是促凋亡和重要的抗癌基因。但在預適應過程中，二者均發(fā)生明顯的線粒體轉(zhuǎn)位。δPKC可改變細胞內(nèi)Ca2+相關信號轉(zhuǎn)導，影響細胞膜電位，導致細胞色素C釋放，激活caspase-3，啟動細胞凋亡；εPKC主要通過開啟KATP，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）的開啟，發(fā)揮心肌保護作用。Chen等［50］運用基因相關技術，在小鼠心臟中分別特異性激活和抑制δPKC和εPKC，證實εPKC主要介導心肌保護，δPKC主要介導心肌損傷。

5 小結(jié)與展望

目前，關于三型PKC的主要生物學作用已基本明確，在EP心肌保護效應中，PKC蛋白和基因表達變化的研究也已開展，但研究相對缺乏系統(tǒng)性，仍需從以下幾方面深入研究：

1.定量研究：在前期研究基礎上，通過免疫沉淀、Western Blot和PCR等技術，對EP心肌保護效應中PKC各亞型蛋白和mRNA表達量及其變化趨勢進行研究。

2.定位研究：通過免疫組織化學法和原位雜交技術，觀察EP早晚期保護效應中PKC各亞型蛋白和基因的表達位置，對PKC蛋白和基因表達進行定位和位置變化研究。

3.PKC亞型間關系研究：通過基因技術或藥物，抑制或過表達一個或幾個特定PKC亞型，觀察對其他PKC亞型磷酸化及下游效應物質(zhì)的影響，更好地模擬在體生理環(huán)境下PKC亞型間關系，驗證PKC亞型間是否存在潛在通路，且EP對潛在通路是否產(chǎn)生影響，如何調(diào)控PKC亞型的比例關系。

4.運動方式研究：一次或反復多次短暫高強度運動，可誘導EP心肌保護效應，這種運動方式被稱為“經(jīng)典EP”。需研究其他方式、強度和持續(xù)時間的運動能否產(chǎn)生與“經(jīng)典EP”類似的心肌保護效應，何種運動方式可更好誘導心肌保護，PKC亞型的表達有何不同。

5.應用性研究：在前期EP相關研究基礎上，開展普通人群及特殊人群（如運動員、冠心病患者等）的心肌保護作用研究，觀察EP對運動員競技水平的提高、冠心病患者生活質(zhì)量的改善是否存在幫助，及PKC亞型的變化趨勢。

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