董 浩，吳清民

（中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 農(nóng)業(yè)部動物流行病和人畜共患病重點實驗室，北京100193）

二元調(diào)控系統(tǒng)是一種可以對環(huán)境信號進行感應(yīng)、傳遞并做出相應(yīng)適應(yīng)的調(diào)控機制。典型的二元調(diào)控系統(tǒng)通常是由與細胞膜結(jié)合的組氨酸激酶（histidine kinases，HK）和含有天冬氨酸殘基的反應(yīng)蛋白（response regulator，RR）組成，通過磷酸化的方式完成信號的傳遞。該信號傳遞過程由3個依次進行的3個酶促磷酰基團轉(zhuǎn)移反應(yīng)組成：①組氨酸激酶與三磷酸腺苷（ATP）中的磷?；鶊F結(jié)合，使組氨酸激酶磷酸化（自磷酸化）；②組氨酸激酶將磷?；鶊F傳遞給反應(yīng)蛋白的天冬氨酸殘基，使反應(yīng)蛋白構(gòu)象發(fā)生改變（轉(zhuǎn)移磷酸化）；③磷酸化的反應(yīng)蛋白與水反應(yīng)失去磷?；鶊F（去磷酸化）。在真核生物中，只有酵母和擬南芥中發(fā)現(xiàn)過少量二元調(diào)控系統(tǒng)，而在原核生物的基因組中平均有約1%的基因編碼不同的二元調(diào)控系統(tǒng)。在細菌中，二元調(diào)控系統(tǒng)不僅參與感應(yīng)pH、養(yǎng)分、滲透壓、抗生素、氧化還原狀態(tài)等環(huán)境信號，還控制著對細菌生長、毒力、生物膜、趨化性、趨光性和群體感應(yīng)等有重要作用的基因簇［1］。對細菌二元調(diào)控系統(tǒng)的研究，在揭示細菌與周圍環(huán)境之間的相互作用、細菌的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及病原菌的致病機制與防治等多個方面都有重要意義。本文綜述了布魯菌二元調(diào)控系統(tǒng)的研究現(xiàn)狀及二元調(diào)控系統(tǒng)在布魯菌病防控中的應(yīng)用。

1 布魯菌的二元調(diào)控系統(tǒng)

布魯菌是一種革蘭陰性的胞內(nèi)寄生菌。由布魯菌感染引起的布魯菌?。ú疾。┦且环N嚴重的人獸共患病，給養(yǎng)殖業(yè)、人類健康和動物源性食品安全帶來很大的威脅。布病在世界各地都廣泛流行，據(jù)報道有123個國家和地區(qū)發(fā)生過該病，主要分布在亞洲、非洲和中南美洲。目前世界上除了少數(shù)幾個發(fā)達國家宣布根除了布魯菌病外，大多數(shù)國家都存在該?。?］，每年全世界因布病造成的經(jīng)濟損失高達數(shù)億美元。

與其他的病原菌相比，布魯菌不具有經(jīng)典的毒力因子。其致病機制主要是布魯菌具有在各種宿主細胞，如吞噬細胞內(nèi)極強的生存和增殖能力。布魯菌被吞噬細胞吞噬后，需要應(yīng)對酸性pH、缺氧、活性氧介質(zhì)（reactive oxygen species，ROS）、活性氮介質(zhì)（reactive nitrogen species，RNS）、營養(yǎng)匱乏等多種不利環(huán)境［3］。迅速地感應(yīng)相應(yīng)的環(huán)境信號并且做出反應(yīng)對于布魯菌在巨噬細胞內(nèi)的生存是至關(guān)重要的。布魯菌基因組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)在布魯菌中存在21個基因假定編碼的二元調(diào)控系統(tǒng)［4］，目前在布魯菌中研究比較清楚的二元調(diào)控系統(tǒng)共有7組。

1.1 BvrR／BvrS二元調(diào)控系統(tǒng)

Sola－Landa A等［5］通過轉(zhuǎn)座子突變技術(shù)篩選到毒力降低的bvrR和bvrS 2個基因的突變株，且這2個突變株對聚合陽離子和表面活性劑敏感性增強。通過同源性比對發(fā)現(xiàn)BvrR／BvrS與根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）的 ChvI／ChvG 及 苜蓿根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）的ChvI－ExoS二元調(diào)控系統(tǒng)具有極高的同源性（87%～89%和70%～80%）。在牛布魯菌中，bvrR和bvrS基因缺失后在小鼠體內(nèi)的毒力顯著降低，在HeLa細胞和鼠源巨噬細胞內(nèi)的侵入能力也是顯著降低，且無法在胞內(nèi)繁殖。

BvrR／BvrS缺失株中外膜蛋白 Omp25和Omp22在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上均顯著降低［6］，并且類脂A的酰基化程度和疏水性都發(fā)生了改變［7］。然而，在Omp22缺失株和Omp25缺失株中天然半抗原多糖成分，LPS和外膜蛋白的表達水平，對于補體殺傷和多黏菌素B的敏感性，以及在細胞模型和動物模型中的生存能力均與野生菌株無顯著差異［8］，說明外膜蛋白表達水平的差異并不是BvrR／BvrS二元調(diào)控系統(tǒng)被破壞后毒力降低的主要原因。

隨著轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組學的發(fā)展，極大地推動了基因功能方面的研究。Viadas C等［9］通過基因芯片的方法對bvrR缺失株進行轉(zhuǎn)錄組分析時發(fā)現(xiàn)，與野生株相比bvrR缺失株有127個基因差異表達（83個基因表達上調(diào)，44個基因表達下調(diào)）；編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶操縱子和麥芽糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的操縱子表達水平下調(diào)；多個與細菌外膜成分，應(yīng)激反應(yīng)，代謝相關(guān)基因以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子差異表達。Martinez－Nunez C等［10］發(fā)現(xiàn)BvrR蛋白可以直接結(jié)合到virB操縱子的啟動子序列上，且影響著群體感應(yīng)系統(tǒng)vjbR基因的表達。這些研究充分闡明了BvrR／BvrS二元調(diào)控系統(tǒng)與細菌毒力之間的關(guān)聯(lián)。值得注意的是這種二元調(diào)控系統(tǒng)調(diào)節(jié)細菌分泌系統(tǒng)表達的機制在根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）、巴爾通體（Bartonella henselae）等其他α－變形菌中普遍存在，說明這種保守的調(diào)節(jié)模式在這些細菌與宿主相互作用過程中發(fā)揮著重要的作用［10］。

1.2 OtpR二元調(diào)控系統(tǒng)

羊種布魯菌的otpR基因的編碼產(chǎn)物具有二元調(diào)控系統(tǒng)的高度保守的結(jié)構(gòu)域，它與下游基因cpk（cAMP依賴的蛋白激酶調(diào)控亞單位）共同構(gòu)成了一個操縱子。OtpR與新月柄桿菌（Caulobacter crescentus）中的CenR蛋白有較高的同源性（indentity：65%，similarity：79%）。otpR基因是通過轉(zhuǎn)座子突變技術(shù)篩選布魯菌毒力相關(guān)基因時發(fā)現(xiàn)其突變株在細胞和小鼠模型中均致弱［11］。進一步研究表明，otpR缺失株在高溫、高滲和低pH環(huán)境中生存能力顯著降低［12］，除此之外otpR基因還對維持細菌的正常細胞形態(tài)以及耐受β－內(nèi)酰胺類抗生素起到關(guān)鍵作用［13］。然而，OtpR作為一個調(diào)節(jié)蛋白不具有接受信號分子的功能區(qū)，其對應(yīng)的感應(yīng)蛋白目前仍是未知的。

1.3 LOV－組氨酸激酶

LOV功能區(qū)在新月柄桿菌（Caulobacter cres－centus）、枯草芽胞桿菌（Bacillis subtilis）和丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）等細菌中與光信號的感應(yīng)相關(guān)。在布魯菌基因組中，有一個含有LOV功能區(qū)的組氨酸激酶（LOV－HK），光照可以增強這個激酶的活性，這說明這個激酶很可能與細菌感應(yīng)光信號密切相關(guān)。Swartz T E等發(fā)現(xiàn)布魯菌在黑暗環(huán)境中培養(yǎng)時，其在細胞模型和小鼠模型中的毒力低于見光培養(yǎng)的布魯菌。而當牛種布魯菌中編碼LOV－組氨酸激酶的基因缺失后，無論缺失株在光照還是黑暗環(huán)境下培養(yǎng)，其在J774A.1巨噬細胞中生存和增殖能力均顯著降低，且和黑暗中培養(yǎng)布魯菌的毒力類似。這充分闡明了LOV組氨酸激酶在介導光照與布魯菌毒力的關(guān)聯(lián)中發(fā)揮著重要的作用。由于布魯菌的生活史與其宿主緊密聯(lián)系，所以布魯菌是何時感應(yīng)光信號就難以解釋。一種可能是當布魯菌隨著被感染的胎盤一起排出體外時，暴露在光源下，LOV－組氨酸激酶調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表達以準備對新宿主的感染［14］。

1.4 NtrY／NtrX二元調(diào)控系統(tǒng)

NtrY／NtrX二元調(diào)控系統(tǒng)在α－變形菌中廣泛存在，ntrY基因的同在田菁莖瘤固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans）、巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）及莢膜紅細菌（Rhodobacter capsulatus）中與細菌的氮代謝以及生物固氮相關(guān)［15－17］。Foulongne V等［19］通過轉(zhuǎn)座子突變了豬布魯菌的ntrY基因，發(fā)現(xiàn)該基因的突變株在人類巨噬細胞中無法生存［18］。Carrica M C等發(fā)現(xiàn)NtrY蛋白是以血紅素為輔因子，可與NO和CO形成復合物，且在存在氧氣的情況下極易被氧化為三價鐵的穩(wěn)定狀態(tài)，由此解釋了NtrY組氨酸激酶感應(yīng)環(huán)境中氧化水平的機制。細菌雙雜交技術(shù)驗證了在布魯菌中NtrY與其下游的NtrX相互作用，即NtrY／NtrX二元調(diào)控系統(tǒng)在布魯菌中也是保守的。進一步的研究表明，ntrY基因缺失后在正常條件下和微氧條件下都影響了反硝化途徑中4個操縱子的表達水平，這說明NtrY／X二元調(diào)控系統(tǒng)很可能與布魯菌在微氧條件下生存是相關(guān)的。

1.5 FeuP／FeuQ二元調(diào)控系統(tǒng)

FeuP／FeuQ是布魯菌中第一個被發(fā)現(xiàn)的二元調(diào)控系統(tǒng)，它與豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）中調(diào)控鐵攝取的二元調(diào)控系統(tǒng)FeuP／FeuQ同源性高達96%。豬布魯菌的feuP基因缺失后在動物模型和細胞模型中均不致弱，而且在缺鐵環(huán)境中的生存能力和野生株也沒有顯著差異［20］。然而Lestrate P等［21］卻發(fā)現(xiàn)在羊布魯菌中feuQ突變株在動物模型和細胞模型中均致弱，這種差異很可能是由于細菌生物型的不同而引起的。

1.6 NtrB／NtrC二元調(diào)控系統(tǒng)

Dorrell N等［22］通過同源性比對發(fā)現(xiàn)在布魯菌存在一個與NtrC轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族同源性高達90%的基因。NtrC與感應(yīng)蛋白NtrB組成一個二元調(diào)控系統(tǒng)NtrB／NtrC。在其他多種細菌中，NtrB／NtrC二元調(diào)控系統(tǒng)與細菌的氮代謝以及毒力相關(guān)。豬種布魯菌的ntrC基因缺失株在不同溫度條件下生長速度沒有差別，然而當存在多種氨基酸時，缺失株的代謝活性降低。與親本菌株相比，ntrC基因缺失株在巨噬細胞內(nèi)的生存和增殖能力沒有差別，但是在小鼠感染過程中ntrC基因缺失株在小鼠脾臟內(nèi)增殖的速度要低于親本菌株。

1.7 PrlS／PrlR二元調(diào)控系統(tǒng)

PrlS／PrlR二元調(diào)控系統(tǒng)是由含有N端鈉離子／溶質(zhì)共轉(zhuǎn)運功能區(qū)的組氨酸激酶（PrlS）和屬于LuxR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（PrlR）組成。在體外環(huán)境中，PrlS／PrlR二元調(diào)控系統(tǒng)缺失的菌株無法在高滲環(huán)境中出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。進一步的試驗表明這個二元調(diào)控系統(tǒng)感應(yīng)的信號與離子強度相關(guān)，而且PrlS／PrlR二元調(diào)控系統(tǒng)的缺失株在小鼠模型中生存能力顯著降低［23］。

2 二元調(diào)控系統(tǒng)在布魯菌病防控中的應(yīng)用

由于編碼組氨酸激酶（HK）和反應(yīng)蛋白（RR）的基因只存在于原核生物以及少數(shù)低等真核生物的基因組中，這使得病原菌的二元調(diào)控系統(tǒng)成為一個理想的抗菌藥物靶點。此外，和傳統(tǒng)的抗菌藥物不同，二元調(diào)控系統(tǒng)抑制物阻斷了二元調(diào)控系統(tǒng)對毒力因子的調(diào)控從而降低病原菌的毒力，而并非殺死病原菌，極大地降低了細菌耐藥性的產(chǎn)生［24］。目前，在致病性大腸埃希菌，結(jié)核分支桿菌及根癌農(nóng)桿菌等細菌中已經(jīng)鑒定出多種二元調(diào)控系統(tǒng)的抑制物［25－26］。盡管現(xiàn)在尚無布魯菌二元調(diào)控系統(tǒng)抑制物方面的報道，但是這種方法可以很好的解決傳統(tǒng)布病治療過程中長期服用抗生素易產(chǎn)生耐藥性的缺陷，因此在治療人布魯菌病方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，雖然已有S19、RB51和Rev.1等多個布魯菌疫苗株，但其安全性和免疫保護力仍無法令人滿意，因此尋找更安全更有效布魯菌疫苗的研究從未停止。鑒于bvrR／bvrS缺失株具有毒力弱，光滑型LPS表型，且在常規(guī)細菌培養(yǎng)基中生長良好等特性，人們嘗試著使用bvrR／bvrS缺失株去開發(fā)新型布魯菌病疫苗。用bvrR／bvrS缺失株免疫小鼠后用牛種布魯菌2308攻毒，所產(chǎn)生的免疫保護力與S19一致，并且效果優(yōu)于RB51。更重要的是在bvrR／bvrS缺失株中不產(chǎn)生Omp3b蛋白，可以用于血清學鑒別。由于基因缺失疫苗菌株需要在宿主體內(nèi)存活足夠長的時間才能建立起持久有效的免疫力，在這方面bvrR／bvrS缺失株還是存在不足。將bvrS缺失株與粗糙型wbkA缺失株共同接種Balb／c小鼠可以顯著地延長細菌在小鼠體內(nèi)的存在時間，而且在使用牛種布魯菌攻毒時能產(chǎn)生比S19更好的免疫保護力［27］。除了bvrR／bvrS缺失株，研究者們也嘗試使用otpR缺失株開發(fā)新型布魯菌疫苗，然而和bvrR／bvrS缺失株類似，由于otpR缺失株在動物模型中很快即被清除，因此無法建立起有效的免疫保護力（資料未發(fā)表）。

3 展望

目前，布魯菌中還有多個二元調(diào)控系統(tǒng)未被研究過，鑒于布魯菌的二元調(diào)控系統(tǒng)對于細菌抵御宿主的各種防御機制至關(guān)重要，布魯菌二元調(diào)控系統(tǒng)的深入研究對于揭示布魯菌的致病機制將起到重要的作用。除此之外，由于人類細胞主要采用絲氨酸／蘇氨酸和酪氨酸激酶系統(tǒng)調(diào)節(jié)蛋白活性，在哺乳動物細胞中也不存在組氨酸激酶，這使得通過阻斷布魯菌的二元調(diào)控系統(tǒng)實現(xiàn)控制布魯菌感染成為一種理論上安全且有效的方法。因此，尋找布魯菌二元調(diào)控系統(tǒng)的抑制物無疑對抗布魯菌感染具有重大的意義。

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