顧亞云,陳建華

(中國藥科大學(xué)分子生物學(xué)教研室,江蘇南京210009)

靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備6-脫氧-6-氨基(N-羥乙基)-α-L-呋喃山梨糖的研究

顧亞云,陳建華

(中國藥科大學(xué)分子生物學(xué)教研室,江蘇南京210009)

以N-羥乙基葡萄糖胺為底物,采用氧化葡萄糖酸桿菌靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備6-脫氧-6-氨基(N-羥乙基)-α-L-呋喃山梨糖,考察了生物轉(zhuǎn)化條件(溫度、p H值、搖床轉(zhuǎn)速、細(xì)胞濃度、底物濃度、金屬離子、轉(zhuǎn)化時(shí)間等)對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響,并通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn),確定搖瓶轉(zhuǎn)化的最優(yōu)條件如下:反應(yīng)溫度為25℃,p H值為6.0,搖床轉(zhuǎn)速為200 r· min-1,細(xì)胞濃度為60 g·L-1,底物濃度為60 g·L-1,轉(zhuǎn)化時(shí)間為48 h,在此條件下目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率為87.5%。研究還發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化液中添加Mg2+對轉(zhuǎn)化具有促進(jìn)作用。

氧化葡萄糖酸桿菌;靜息細(xì)胞;生物轉(zhuǎn)化

降糖藥米格列醇(Ⅰ)是一種新型的α-葡萄糖苷酶抑制劑,其通過抑制小腸粘膜上皮細(xì)胞表面的α-葡萄糖苷酶來延緩碳水化合物的吸收,降低餐后高血糖,適用于餐后高血糖為主要表現(xiàn)的患者[1]。Grabner等[2]提出了一種簡便的化學(xué)生物組合工藝合成米格列醇,合成路線如圖1所示。該路線簡便、無污染,關(guān)鍵中間體6-脫氧-6-氨基(N-羥乙基)-α-L-呋喃山梨糖(Ⅱ)的制備是該工藝的關(guān)鍵和難點(diǎn)。

作者在此用氧化葡萄糖酸桿菌靜息細(xì)胞高效轉(zhuǎn)化N-羥乙基葡萄糖胺(Ⅲ)制備6-脫氧-6-氨基(N-羥乙基)-α-L-呋喃山梨糖(Ⅱ),以期獲得高效、低成本的米格列醇生產(chǎn)工藝。

圖1 以N-羥乙基葡萄糖胺為底物合成米格列醇的化學(xué)生物組合法路線Fig.1 The synthetic route of miglitol with N-hydroxyethyl-glucosamine as substrate by the combined biotechnological-chemical method

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株、試劑與儀器

氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxy dans),自行保藏。

濃鹽酸、甲醇、氨水、氯化鈉、氫氧化鈉,南京化學(xué)試劑有限公司;硫酸鎂、硫酸銅,上海美興化工股份有限公司;碘、瓊脂粉、L-谷氨酸鈉,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;N-羥乙基葡萄糖胺,山東新時(shí)代有限公司。

HP1100系列高效液相色譜儀(包括Agilent 1100系列泵系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測器和示差折光檢測器),安捷倫科技有限公司;冷凍離心機(jī),德國希格瑪離心機(jī)有限公司;臺(tái)式恒溫振蕩培養(yǎng)箱,上海智城分析儀器制造公司;721型可見分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 培養(yǎng)基及溶液配制

斜面培養(yǎng)基:山梨醇4%,酵母粉1.25%, KH2PO40.3%,MgSO4·7 H2O 0.1%,谷氨酸鈉0.1%,瓊脂2%。

種子培養(yǎng)基:山梨醇4%,酵母粉1.25%, KH2PO40.3%,MgSO4·7H2O 0.1%,谷氨酸鈉0.1%。

發(fā)酵培養(yǎng)基:山梨醇10%,酵母粉1.5%, KH2PO40.3%,MgSO4·7 H2O 0.1%,谷氨酸鈉0.1%。

轉(zhuǎn)化液配制:精確稱取一定量N-羥乙基葡萄糖胺溶于水中,定容,用濃鹽酸調(diào)p H值至6.0,經(jīng)0.45μm微孔過濾器過濾,得到無菌轉(zhuǎn)化底物溶液。

1.3 方法

1.3.1 靜息細(xì)胞的制備

在無菌操作下,取一環(huán)純化的斜面菌種接入裝有50 m L種子培養(yǎng)基的250 m L三角搖瓶中,30℃、220 r·min-1下振蕩培養(yǎng)24 h。將種子培養(yǎng)液按5%(體積分?jǐn)?shù))接種到裝有100 m L發(fā)酵培養(yǎng)基的500 m L三角搖瓶中,30℃、220 r·min-1下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期的末期。8000 r·min-1下離心,取菌體,蒸餾水洗滌2次得靜息細(xì)胞。

1.3.2 靜息細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

取適量靜息細(xì)胞加入到裝有20 mL轉(zhuǎn)化液的250 m L三角瓶中,25℃、200 r·min-1下?lián)u床培養(yǎng)一定時(shí)間。

1.3.3 HPLC檢測

色譜條件:Lichrospher 5-NH2色譜柱(4.6 mm× 250 mm);柱溫35℃;流動(dòng)相為乙腈-水(90∶10);流速1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量20μL。根據(jù)峰面積計(jì)算6-脫氧-6-氨基(N-羥乙基)-α-L-呋喃山梨糖的含量[3]。

2 結(jié)果與討論

2.1 原始菌株靜息細(xì)胞的轉(zhuǎn)化條件

2.1.1 溫度對轉(zhuǎn)化的影響

取一定量的靜息細(xì)胞,加入到20 m L/250 m L的反應(yīng)體系中,分別于不同溫度下反應(yīng)1 h,測定反應(yīng)液中的產(chǎn)物含量,結(jié)果見圖2。

由圖2可知,隨著溫度的升高,反應(yīng)液中的產(chǎn)物含量先增加后減少,溫度為25℃時(shí)的產(chǎn)物含量最大,表明此時(shí)靜息細(xì)胞的催化活性最強(qiáng)。因此,選擇最適溫度為25℃。

圖2 溫度對轉(zhuǎn)化的影響Fig.2 Effect of temperature on the conversion

2.1.2 p H值對轉(zhuǎn)化的影響

取一定量靜息細(xì)胞,加入到20 m L/250 m L的反應(yīng)體系中,調(diào)節(jié)體系p H值,于25℃下反應(yīng)1 h,測定反應(yīng)液中的產(chǎn)物含量,結(jié)果見圖3。

圖3 p H值對轉(zhuǎn)化的影響Fig.3 Effect of p H value on the conversion

由圖3可知,反應(yīng)體系的p H值為6.0時(shí),反應(yīng)液中的產(chǎn)物含量最大。因此,選擇最適p H值為6.0。

2.1.3 搖床轉(zhuǎn)速對轉(zhuǎn)化的影響

取一定量的靜息細(xì)胞,加入到20 m L/250 m L的反應(yīng)體系中,于25℃、p H值6.0、不同搖床轉(zhuǎn)速下反應(yīng)1 h,測定反應(yīng)液中的產(chǎn)物含量,結(jié)果見圖4。

圖4 搖床轉(zhuǎn)速對轉(zhuǎn)化的影響Fig.4 Effect of rotation speed on the conversion

由圖4可知,隨著搖床轉(zhuǎn)速的加快,反應(yīng)液中的溶氧水平也逐步提高,產(chǎn)物含量有所增加,但搖床轉(zhuǎn)速超過200 r·min-1后,產(chǎn)物含量反而減少。因此,選擇最適搖床轉(zhuǎn)速為200 r·min-1。

2.1.4 細(xì)胞濃度對轉(zhuǎn)化的影響

精確稱取一定量濃度為20 g·L-1、40 g·L-1、60 g·L-1、80 g·L-1、100 g·L-1的靜息細(xì)胞,加入到20 m L/250 m L的反應(yīng)體系中,于25℃、p H值6.0、200 r·min-1下反應(yīng)1 h,測定反應(yīng)液中的產(chǎn)物含量,結(jié)果見圖5。

圖5 細(xì)胞濃度對轉(zhuǎn)化的影響Fig.5 Effect of cell concentration on the conversion

由圖5可知,細(xì)胞濃度從20 g·L-1提高至60 g ·L-1時(shí),反應(yīng)液中的產(chǎn)物含量也隨之增加;但細(xì)胞濃度大于60 g·L-1時(shí),產(chǎn)物含量反而有所減少。因此,選擇最適細(xì)胞濃度為60 g·L-1。

2.1.5 底物濃度對轉(zhuǎn)化的影響(圖6)

圖6 底物濃度對轉(zhuǎn)化的影響Fig.6 Effect of substrate concentration on the conversion

由圖6可知,隨著底物濃度的增大,反應(yīng)液中產(chǎn)物含量先增后減,在底物濃度為80 g·L-1時(shí)產(chǎn)物含量最大;進(jìn)一步提高底物濃度,底物對細(xì)胞活性的抑制作用開始顯現(xiàn),產(chǎn)物含量減少。因此,選擇最適底物濃度為80 g·L-1。

2.1.6 金屬離子對轉(zhuǎn)化的影響

金屬離子主要是作為酶的激活劑或抑制劑影響轉(zhuǎn)化的過程。一些金屬離子對轉(zhuǎn)化的影響見圖7。

圖7 不同金屬離子對轉(zhuǎn)化的影響Fig.7 Effect of various metal ions on the conversion

由圖7可知,在轉(zhuǎn)化液中添加Mg2+對轉(zhuǎn)化具有促進(jìn)作用,而Fe3+、Cu2+、Ca2+、Mn2+、Co2+在不同程度上抑制了靜息細(xì)胞的活性,其中又以Fe3+的抑制作用最強(qiáng)。

2.1.7 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件

以轉(zhuǎn)化時(shí)間、底物濃度及細(xì)胞濃度為考察因素,進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件,正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Tab.1 Results and analysis of orthogonal experiment

由表2可知,優(yōu)化的轉(zhuǎn)化條件為:底物濃度60 g· L-1,靜息細(xì)胞濃度60 g·L-1,轉(zhuǎn)化時(shí)間48 h。

2.1.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用對數(shù)生長末期(24 h)的菌體作為靜息細(xì)胞,底物濃度為60 g·L-1,細(xì)胞濃度為60 g·L-1,濃鹽酸調(diào)p H值至6.0,裝液量為20 m L/250 m L,在25℃、200 r·min-1下轉(zhuǎn)化48 h,測定產(chǎn)物含量。經(jīng)計(jì)算,6-脫氧-6-氨基(N-羥乙基)-α-L-呋喃山梨糖的產(chǎn)率為87.5%,證明所確定的優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件可靠。

2.2 靜息細(xì)胞的重復(fù)使用性(圖8)

圖8 靜息細(xì)胞的重復(fù)使用性Fig.8 The reusability of resting cells

由圖8可知,隨著使用次數(shù)的增加,靜息細(xì)胞的催化能力明顯下降,表明細(xì)胞的穩(wěn)定性較差。

2.3 討論

氧化葡萄糖酸桿菌是一種專性好氧的革蘭氏陰性菌,屬于醋酸桿菌科(Acetobacteraceae),是微生物工業(yè)的理想菌種。參與微生物氧化的山梨醇脫氫酶[4]為依賴PQQ的膜結(jié)合脫氫酶,定位于內(nèi)膜,主要進(jìn)行不完全氧化,催化底物反應(yīng)的過程中無需底物和產(chǎn)物的透膜運(yùn)輸,大大提高了其應(yīng)用價(jià)值。

靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化[5]是將菌體生長與產(chǎn)物形成過程分開,當(dāng)菌體生長到對數(shù)末期后,收獲細(xì)胞,然后以細(xì)胞為催化劑,進(jìn)行催化反應(yīng)。該法利用對菌體生長抑制較小的碳源,解除底物和產(chǎn)物對細(xì)胞生長的抑制;轉(zhuǎn)化過程中不涉及菌體生長,有利于產(chǎn)物的分離提取;轉(zhuǎn)化過程操作簡單。據(jù)報(bào)道[6],氧化葡萄糖酸桿菌生長進(jìn)入對數(shù)生長末期時(shí),其靜息狀態(tài)細(xì)胞膜脫氫酶的氧化活力最高。本研究采用對數(shù)生長末期的菌體作為靜息細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化,通過對生物轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化,目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率達(dá)到87.5%,為高效合成米格列醇奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

以N-羥乙基葡萄糖胺為底物,采用氧化葡萄糖酸桿菌靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備6-脫氧-6-氨基(N-羥乙基)-α-L-呋喃山梨糖,通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn),確定最優(yōu)的轉(zhuǎn)化條件如下:反應(yīng)溫度為25℃,搖床轉(zhuǎn)速為200 r ·min-1,p H值為6.0,細(xì)胞濃度為60 g·L-1,底物濃度為60 g·L-1,轉(zhuǎn)化時(shí)間為48 h,在此條件下目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率為87.5%。研究還發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化液中添加Mg2+對轉(zhuǎn)化具有促進(jìn)作用。

[1] Lesley J S,Caroline M S.Miglitol:A review of its therapeutic potential in typeⅡdiabetes Mellitus[J].Drugs,2000,59(3):521-549.

[2] Grabner R W,Landis B H,Wang P T,et al.Process for producing N-substituted-1-deoxynojirimycin[P].EP 0 477 160,1991-09-19.

[3] Chen J,Chen J H,Zhou C L.Simple-high performance liquid chromatographic methods for the quantitative determination of dihydroxyacetone and glycerol in the fermentation broth and a comparison with a visible spectrophotometric method to determine dihydroyacetone[J].Chromatographi Science,2008,46(10):912-916.

[4] Yang X P,Wei L J,Lin J P,et al.Membrane-bound pyrrolo-quinoline quinone-dependent dehydrogenase in Gluconobacter oxydans M5,responsible for production of 6-(2-hydroxyethyl)amino-6-deoxy-l-sorbose[J].Appl Environ Microbiol,2008,74(16):5250-5253.

[5] 尹秀蓮,游慶紅.氧化葡萄糖酸桿菌培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化1,2-丙二醇生產(chǎn)D-乳酸研究[J].中國釀造,2010,(3):64-66.

[6] Claus G W.Effect of intracytoplasmic membrance development on oxidation of sorbitol and other polyols by Gluconobacter oxydans [J].Bacteriol,1982,150(2):934-943.

Synthesis of 6-(N-Hydroxyethyl)amino-6-deoxy-α-L-sorbofuranose by Transformation with Resting Cells

GU Ya-yun,CHEN Jian-hua
(Department of Molecular Biology,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China)

With N-hydroxyethyl-glucosamine as substrate,6-(N-hydroxyethyl)amino-6-deoxy-α-L-sorbofuranose was synthesized through biotransformation with resting cells of Gluconobacter oxy dans.The effects of biotransformation conditions such as temperature,p H value,rotation speed,cell concentration,substrate concentration, metal ions and transformation time on the transformation reaction were explored.Through single factor experiment and orthogonal experiment,the optimal transformation conditions were determined as follows:temperature was 25℃,p H value was 6.0,rotation speed was 200 r·min-1,cell concentration was 60 g·L-1,substrate concentration was 60 g·L-1,transformation time was 48 h.Under above conditions,yield of the target compound reached 87.5%.It was found that adding Mg2+to the transformation liquor was benefit to the biotransformation.

Gluconobacter oxydans;resting cells;biotransformation

TQ 233.1

A

1672-5425(2013)07-0047-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.07.013

2013-04-15

顧亞云(1988-),女,江蘇南通人,碩士研究生,研究方向:生物轉(zhuǎn)化,E-mail:guyayun19881121@126.com;通訊作者:陳建華,教授,E-mail:jhchen@cpu.edu.cn。