高 璐，杭 莉，楊振泉，唐 偉，高 崧，方維明

2.揚州大學獸醫(yī)學院，揚州 225009；

3.泰州市疾病預防控制中心，泰州 225300；

4.泰州市出入境檢驗檢疫局，泰州 225300

弧菌是水生動物弧菌病的病原體，是一群菌體短小、桿狀或彎曲成弧狀的革蘭氏陰性菌，廣泛分布在自然界中，以海水、淡水和水生動物身體居多，其中12種與人類腸內(nèi)、腸外感染有關(guān)［1］，分別是霍亂弧菌（V.cholerae）、擬態(tài)弧菌（V.mimicus）、梅契尼柯夫弧菌（V.metschnikovii）、霍利斯弧菌（V.hollisae）、海魚弧菌（V.damsela）、河流弧菌（V.fluvialis）、弗尼斯弧菌（V.furnissii）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）、創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus）、辛辛那提弧菌（V.cincinnatiensis）和鯊魚弧菌（V.carchariae）。在這12種致病性弧菌中，危害最大、最常見的是副溶血弧菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌和擬態(tài)弧菌，其中O1型霍亂弧菌被WHO定為檢疫菌，副溶血弧菌是水產(chǎn)品國際檢測菌種［2］。

目前海水產(chǎn)品中以副溶血弧菌、霍亂弧菌為主的致病性弧菌污染情況，海水、海洋沉積物中弧菌的分布和菌群多樣性分析屢見報道，淡水產(chǎn)品中副溶血弧菌的污染情況也偶有報道［3］，但淡水產(chǎn)品中弧菌污染情況及菌群多樣性卻未見報道。本研究主要了解江蘇省部分地區(qū)淡水產(chǎn)品中弧菌菌群的分布和分離株的致病性，為建立江蘇省水產(chǎn)品尤其是淡水產(chǎn)品中弧菌的膳食暴露水平及危險評估提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源：副溶血性弧菌標準菌株ATCC33847（tdh＋trh－）由上海疾病預防與控制中心饋贈，本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 TCBS瓊脂購于杭州微生物試劑有限公司；我萋氏培養(yǎng)基購于青島海博生物技術(shù)公司；PCR所用生物試劑（10×Buffer、RNase、Taq酶、d NTPs、DNA Marker）為上海生工生物工程技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

SPX－250－250B－Z型生化培養(yǎng)箱（上海博訊），PTC－100 PCR儀（美國 MJ公司），DYY－8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京市六一儀器廠），TG16－WS型高速離心機（湘儀離心機儀器有限公司），GELDOCXR凝膠成像系統(tǒng)（BIO－RAD公司），CO2培養(yǎng)箱（Heal Force公司）。

1.2 樣品采樣 從江蘇省連云港市、揚州市、常州市、泰州市的超市及農(nóng)貿(mào)市場，按隨機采樣原則采集55份鮮活淡水產(chǎn)品，其中魚類26份，貝類3份，蟹類10份，蝦類16份。樣品取整只，裝入樣品袋，封口，貼上標簽，4℃冰箱保存，24～36 h內(nèi)送回實驗室分析。

1.3 弧菌分離與生化鑒定 樣品處理和部分生化鑒定試驗參照GB/T 4789.7－2008《食品衛(wèi)生微生物學檢驗副溶血性弧菌檢驗》和《食品衛(wèi)生微生物檢驗標準手冊》進行。

1.4 弧菌菌群的分子鑒定

1.4.1 弧菌基因組 DNA 提?。簠⒄瘴墨I［4］或《精編分子生物學實驗指南》的CTAB法提取弧菌分離株基因組DNA。

至此，方向機單元軟件升級操作完成，故障代碼“B200500記錄無效”記錄可以刪除。接下來需要寫入?yún)?shù)，對方向機進行參數(shù)化操作。

1.4.2 引物設(shè)計：分別選取副溶血性弧菌、溶藻弧菌的種特異性tlh［5］基因、HSP60基因［6］作為靶基因?qū)CBS菌群分離株進行分群；再利用細菌16S－r DNA通用引物［7］對其余的分離株進行16S－r DNA PCR擴增分析。同時對副溶血性弧菌分離株的致病基因耐熱性溶血素基因（tdh）［4］和耐熱性溶血素相關(guān)毒素基因（trh）［4］進行檢測。所有引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。引物序列見表1。

表1 弧菌PCR檢測引物序列Tab.1 Oligonucleotide primers used for PCR

1.4.3 PCR 擴增：根 據(jù)相 應文獻［4－7］中的 PCR 反應體系和擴增程序進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4.4 菌株16S r DNA 序列分析：16S r DNA PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其片段大小為1500bp，送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進行測序，將測序所得序列經(jīng)NCBI比對后，通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫進行對比分析（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast），選取同源性高的菌株，采用Clusalx軟件對比分析，運用Mega4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 神奈川（KP）試驗 將我妻氏基礎(chǔ)培養(yǎng)基按說明書加超純水煮沸，冷卻至45℃左右時，加入新鮮兔血紅細胞10%，混合均勻，傾注平皿；將各分離株純培養(yǎng)物點種于血瓊脂表面，37℃培養(yǎng)16 h，觀察溶血現(xiàn)象，如有溶血現(xiàn)象則說明KP試驗結(jié)果陽性。1.6 小鼠腸致病性的測定 對神奈川試驗陽性且溶血圈大于4 mm的弧菌分離株進行小鼠腸致病性的測定，弧菌分離株LBS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h后于4℃，8 000 r/mim離心5 min，收集菌體，根據(jù)預實驗平板計數(shù)結(jié)果用PBS調(diào)整成108CFU/m L的菌懸液對6周齡雌性ICR小鼠進行灌胃0.5 m L，每個菌株灌胃5只小鼠，PBS灌胃作為陰性對照，觀察小鼠的發(fā)病和死亡情況，灌胃24 h后解剖小鼠取小腸觀察病變情況。取小鼠胃下20 cm左右腸段，測定長度L（cm），放在平皿中稱取其重量 W1（mg），然后放在烘箱內(nèi)80℃烘干12 h后稱取重量W2（mg），按公式FA＝（W1－W2）/L計算每只小鼠腸內(nèi)液體累積率FA（mg/cm），用每組小鼠腸內(nèi)液體累積率（FA）平均值反映菌株的腸致病性。

2 結(jié) 果

2.1 樣品中弧菌的分離結(jié)果 樣品通過增菌后在TCBS平板上生長的大多為表面光滑、呈圓形的黃色或藍綠色菌落，直徑1～3 mm，按比例隨機挑取不同形態(tài)和顏色的菌落256株，經(jīng)純化后制成15%甘油菌懸液－70℃保存?zhèn)溆?。對純化后的分離株進行生化實驗，結(jié)果表明，所有分離株均是革蘭氏陰性菌；243株分離株為氧化酶試驗陽性；嗜鹽性試驗中3株0%陽性、所有分離株3%和6%均為陽性、106株10%陽性；三糖鐵試驗中8株TSI斜面變黃底部顏色不變、90株斜面不變底部發(fā)黃、11株培養(yǎng)基顏色不變、17株培養(yǎng)基變黃且產(chǎn)氣、4株培養(yǎng)基變黃且底部發(fā)黑、126株培養(yǎng)基全部變黃。

2.2 分離株的PCR結(jié)果 對于所有分離株分別用副溶血弧菌的種特異性引物tlh和溶藻弧菌的特異性引物hsp60進行PCR擴增鑒定。tlh基因陽性的菌株在450 bp處出現(xiàn)特異性擴增條帶，256株分離株中共有83株出現(xiàn)tlh基因陽性條帶，如圖1所示；hsp60基因陽性的菌株在560 bp處會出現(xiàn)特異性條帶，本試驗中共有130株分離株有此條帶，見圖2。

圖1 副溶血弧菌tlh基因的PCR擴增Fig.1 Molecular identification of V.parahaemolyticus isolates by amplifying tlh geneM：DNA marker；1：Negative control；2－5：Vibrio isolates

圖2 溶藻弧菌HSP60基因的PCR擴增Fig.2 Molecular identification of V.alginolyticus isolates by amplifying HSP60 geneM：DNA marker；1－3：Vibrio isolates；4：Negative control

2.3 弧菌分離株的16S r DNA序列Blasten結(jié)果對基因tlh和HSP60陰性分離株（共43株）進行16S r DNA擴增，擴增片段大小為1 500 bp的PCR產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測序，序列在Gen－Bank上進行Blasten分析。結(jié)果顯示，43株分離株中共有9種弧菌，其中，Vibrioparahaemolyticus2株、Vibrioalginolyticus1株 、Vibrioharveyi8 株、Vibrioazureus5株、Vibriometschnikovii3株、Vibrioaestuarianus3株 、Vibrioowesii1株 、Vibrio diazotrophicus1株和Vibrionatriegens1株。此外，有18株分離菌株屬于弧菌屬相近屬的細菌，如：Leclerciasp3株，Pseudomonasfluorescens6株和Aeromonasenteropelogenes9株。部分分離菌株測序結(jié)果見表2。

表2 部分分離株的16S r DNA序列Blasten結(jié)果Tab.2 Blasten results of 16S r DNA of Vibrio isolates

2.4 淡水產(chǎn)品中弧菌的檢出率 隨機采集的4類淡水產(chǎn)品共55份，共分離出256株弧菌分離株。根據(jù)生化試驗結(jié)果、特異性基因分析及16S r DNA PCR結(jié)果分析，55份樣品中共分離出9種弧菌，其檢出率見表3。

由表3可知，我省部分地區(qū)淡水產(chǎn)品中弧菌的污染也較為普遍，弧菌菌群結(jié)構(gòu)具有豐富的多樣性，其中副溶血弧菌、溶藻弧菌是優(yōu)勢菌群。不同地區(qū)和不同樣品中的弧菌菌群和弧菌檢出率有所差異，連云港地區(qū)淡水產(chǎn)品中弧菌的檢出率明顯高于揚州、常州、泰州地區(qū)，且其弧菌的種類明顯多于其他地區(qū)；這可能是由于連云港屬于沿海地區(qū)而揚州、常州、泰州是內(nèi)陸地區(qū)；魚、蝦中弧菌的檢出率和弧菌種類明顯高于貝、蟹。

表3 不同地區(qū)不同樣品中弧菌的檢出率Tab.3 Detection rate of Vibrio in samples

2.5 弧菌分離株的致病性 對分離株進行tdh、trh基因PCR擴增。結(jié)果顯示所有分離株均未擴增出tdh、trh條帶，說明這些副溶血弧菌分離株均不攜帶tdh、trh致病性相關(guān)基因。

神奈川（KP）試驗結(jié)果顯示，256株分離株中35株有明顯透明溶血圈（直徑＞2mm），占所有分離株的15.02%。其中弧菌中V.parahaemolyticus12株，V.alginolyticus13株，V.harveyi1株，V.aestuarianus2株，V.azureus3 株，V.metschnikovii1株 ，V.owensii1株 。

小鼠腸致病性實驗結(jié)果顯示，所有灌胃小鼠均沒有死亡，但所有分離株灌胃小鼠均出現(xiàn)不同程度的小腸積水、腸壁充血效應（變紅），有的腸腔內(nèi)出現(xiàn)黃色或淡紅色積水，腸壁變薄，腸液累積率（FA）見表4。由表4可見，所有弧菌的腸液累積率均高于陰性對照組。經(jīng)SPSS軟件統(tǒng)計學分析，有6株分離株腸液累積率均顯著大于陰性對照組（P＜0.05），表明大多數(shù)的KP＋分離株能引起小鼠小腸積水；與陽性對照菌株 ATCC33837（tdh＋trh－）相比，有四株分離株（71、92、203、214）的腸液累積率與其相近，差異不顯著，說明這4個分離株能引起小鼠較嚴重的腸積水現(xiàn)象。相關(guān)性分析顯示，腸液累積率與溶血圈的大小沒有明顯的相關(guān)性。

表4 弧菌分離株腸致病性測定結(jié)果Tab.4 Determination result of intestinal pathogenic for Vibrio isolates

3 討 論

弧菌是影響水產(chǎn)品安全的重要因子，本研究對江蘇省部分地區(qū)的淡水產(chǎn)品進行弧菌菌群的分析，結(jié)果顯示，樣品中弧菌的總檢出率達96.4%（53/55），包括9個弧菌種和3個非弧菌種，其中以副溶血弧菌（74.55%）、溶藻弧菌（85.45%）為主要菌群，表明江蘇省淡水產(chǎn)品中弧菌污染率較高，弧菌種類多樣，存在食品安全風險。本研究中檢出的3個非弧菌種是Leclerciasp，Pseudomonasfluorescens和Aeromonasenteropelogenes，這表明采用TCBS培養(yǎng)基還可以分離出其他細菌，有文獻［8］將其所分離得到的細菌統(tǒng)稱為“TCBS類群細菌”，也與 Wang［9］等人的研究結(jié)果基本一致。因而，在生產(chǎn)實踐及環(huán)境評價過程中，單純通過測定TCBS菌群數(shù)以代表弧菌數(shù)量的做法，可能會導致弧菌數(shù)量的高估和錯估，尤其是在淡水或咸淡水區(qū)域。為獲取更加接近弧菌總數(shù)的真實值，應該在TCBS瓊脂平板計數(shù)的同時，進行TCBS菌株的種屬鑒定。

本研究結(jié)果顯示，不同地區(qū)和不同樣品中的弧菌菌群和弧菌檢出率有所差異。從地區(qū)分布來看，連云港地區(qū)淡水產(chǎn)品中弧菌的檢出率明顯高于揚州、常州、泰州地區(qū)，提示淡水產(chǎn)品中弧菌的攜帶情況可能存在一定的區(qū)域性。Yang等［4］研究表明江蘇省不同地區(qū)副溶血性弧菌的分布也存在一定的差異。從不同種類樣品弧菌的檢出率來看，魚、蝦中弧菌的檢出率和弧菌種類明顯高于貝、蟹，表明魚、蝦可能是弧菌的優(yōu)勢寄生宿主。Yang等［4］研究表明在海產(chǎn)品中貝類、蝦類的副溶血性弧菌攜帶率較高，但是本研究發(fā)現(xiàn)在淡水產(chǎn)品中魚、蝦的弧菌污染率較高。

副溶血弧菌是一種重要的食源性致病菌。目前的研究認為，副溶血弧菌的致病因子主要有耐熱直接溶血毒素（TDH）、耐熱直接相關(guān)溶血毒素（TRH）、不耐熱溶血毒素（TLH），分別由相關(guān)的tdh、trh和tlh基因編碼。TDH和TRH與副溶血弧菌的致病能力關(guān)系密切，大部分臨床分離株都具有由TDH引發(fā)的神奈川現(xiàn)象（KP）［10］，只有少數(shù)環(huán)境和海產(chǎn)品分離株出現(xiàn)此現(xiàn)象。本研究分離到的副溶血弧菌均未檢出tdh和trh基因，但仍有少量分離株表現(xiàn)出KP＋現(xiàn)象。揭示了tdh－菌株仍具有一定的致病風險。

本次從淡水產(chǎn)品中檢出的弧菌分離株256株中共有35株能產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，其中有明顯溶血圈的分離株大多能引起小鼠腸道一定程度的積水現(xiàn)象，但與溶血圈的大小沒有明顯相關(guān)關(guān)系，且都沒有致死小鼠。目前的研究［11］大多認為海產(chǎn)品中存在著弧菌引起的食物中毒風險，但本研究結(jié)果表明這些弧菌分離株具有一定的致病性，說明在淡水產(chǎn)品中也存在食物中毒的風險。因此，我們應倡導消費者養(yǎng)成科學健康的飲食習慣，加強衛(wèi)生監(jiān)督部門對餐飲業(yè)加工各環(huán)節(jié)的衛(wèi)生監(jiān)督，采取有效措施控制弧菌污染淡水產(chǎn)品是非常必要。

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