許蘭嬌 洪智敏 司 微 劉寶生 張錦華 劉思國 黎觀紅＊

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南昌330045；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150001）

雞 β－ 防 御 素 －9（chickenβ－defensin－9，AvBD9）是雞天然免疫的重要組成部分，廣泛分布于皮膚、消化道及呼吸道等黏膜，在雞的免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。AvBD9具有很強(qiáng)的殺滅致病細(xì)菌和真菌活性，而且AvBD9在高鹽濃度（150mmol/L NaCl）條件下對許多致病菌仍具有殺菌活性［1］。天然存在的抗菌肽產(chǎn)量很低，無法從動植物體內(nèi)大量提取。AvBD9作為一種家禽基因編碼的陽離子抗菌肽，其分子質(zhì)量小，易被蛋白酶降解，而且對宿主菌大腸桿菌（Escherichia coli）有毒性，因而不能在大腸桿菌中直接表達(dá)，并且免疫原性較弱，單獨(dú)免疫新西蘭大白兔不能激起較強(qiáng)的免疫應(yīng)答［2－4］，而以融合蛋白形式表達(dá)則可克服這些困難。國內(nèi)外學(xué)者對雞β－防御素在雞各種組織及消化道的分布表達(dá)進(jìn)行了大量研究，表明AvBD9廣泛分布于雞組織中且具有組織特異性表達(dá)特點(diǎn)［5－9］。然而，研究者對 AvBD9在組織中分布表達(dá)的研究僅限于在基因（mRNA）水平上研究。因此，為從蛋白質(zhì)水平上鑒定AvBD9在組織中的合成和分布，AvBD9抗體的制備就顯得非常必要。本研究旨在利用原核系統(tǒng)表達(dá)AvBD9重組蛋白制備兔源多克隆抗體，為AvBD9的檢測及相關(guān)研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物、菌株及質(zhì)粒

2.5kg雌性新西蘭大白兔2只，購自哈爾濱獸醫(yī)研究所動物實(shí)驗(yàn)中心。大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞由哈爾濱獸醫(yī)研究所細(xì)菌室提供，原核質(zhì)粒pGEX－6P－1購自美國GE公司。

1.2 主要試劑

T4DNA連接酶、EcoRⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶、異丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）均購自寶生物工程（大連）有限公司；丙烯酰胺（30%）購自美國Bio－Rad公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Omega公司；凝膠回收試劑盒購自美國羅氏公司；BugBuster蛋白抽提試劑購自德國 Merck公司；辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）、N，N，N’，N’－四甲基乙二胺（TEMED）、Amp＋購自美國Sigma公司；透析袋購自北京索萊寶生物科技有限公司；脫脂乳購自武漢博士德生物工程有限公司；其他試劑購自商業(yè)公司，均為分析純。

1.3 重組載體的構(gòu)建

1.3.1 AvBD9的合成及載體酶切

目的基因片段由上海生工生物公司合成，根據(jù)GenBank登錄號（NM＿001001611）獲取目的基因片段，合成AvBD9的成熟肽DNA全長編碼序列。根據(jù)表達(dá)載體pGEX－6 P－1的結(jié)構(gòu)，在目的序列兩端引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ及SalⅠ。應(yīng)用EcoRⅠ和SalⅠ對合成的AvBD9成熟肽基因片段和pGEX－6 P－1 酶 切；酶 切 體 系 （50μL）：載 體pGEX－6 P－1 10μL，EcoRⅠ1μL，SalⅠ1μL，1×Tango buffer 5μL，dd H2O 33μL。按Promega試劑盒操作說明分別對酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收和定量，回收產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。根據(jù)目的片段與載體摩爾數(shù)比一般為1∶2～10的原則，進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系（10μL）：T4ligase 1.0μL，T4ligase buffer 1.0μL，雙酶切的pGEX－6 P－1 0.5μL，雙酶切的 AvBD9 4.5μL，dd H2O 3.0μL，22℃連接2h。

1.3.2 重組載體的鑒定

將 pGEX－6 P－1－AvBD9 加 入 到100μL 大 腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，混勻內(nèi)容物，無抗性LB液體培養(yǎng)基37℃復(fù)蘇細(xì)菌，將細(xì)菌涂于添加Amp＋抗性的LB培養(yǎng)板中，37℃恒溫培養(yǎng)12～16h出現(xiàn)菌落，挑取菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h。根據(jù)Omega公司質(zhì)粒提取試劑盒步驟提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定，50%甘油保存陽性菌種。

1.4 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

接種陽性克隆菌于LB液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)過夜，按1∶100比例接入LB液體培養(yǎng)基中。37℃恒溫?fù)u床（220r/min）培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600nm值為0.6～1.0），加入IPTG誘導(dǎo)融合蛋白 表 達(dá)4h。IPTG 濃 度 設(shè)5個 梯 度：0.125、0.250、0.500、0.750、1.000mmol/L，溫 度 設(shè) 2 個梯度：25和37℃。誘導(dǎo)表達(dá)后8 000r/min離心10min，用pH 8.0的Tris－HCl清洗菌體后離心，菌體沉淀中加入1/10菌體體積的磷酸鹽緩沖液（PBS）及等體積的2×十二烷基硫酸鈉（SDS）凝膠上 樣 緩 沖 液，煮 沸 10min，12 000r/min離 心15min，十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）鑒定融合蛋白的表達(dá)。同時將誘導(dǎo)的菌 體 離 心，沉 淀 經(jīng) 50mmol/L Tris－HCl（pH 8.5～9.0）、2mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）、100 mmol/L NaCl、0.5%Triton X－100 混 合 液 重 懸。冰上20Hz超聲裂解細(xì)菌細(xì)胞，工作時間3s，間歇3s，總超聲時間為20min。分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS－PAGE電泳。電泳后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，甲醇－冰乙酸脫色液脫色觀察結(jié)果，證實(shí)pGEXAvBD9融合蛋白以包涵體形式存在。

按照Merck公司的BugBuster蛋白抽提試劑說明書進(jìn)行蛋白的純化，去除可溶蛋白，得到純化后的包涵體蛋白。將純化后的包涵體蛋白經(jīng)SDSPAGE電泳后，切取目的條帶即融合蛋白。融合蛋白 電 洗 脫 純 化 按 Laemmli［10］的 方 法 進(jìn) 行，SDSPAGE電泳檢驗(yàn)電洗脫蛋白純度；以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用Bradford法測定純化蛋白濃度。

1.5 AvBD9多克隆抗體的制備

用切膠純化的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶－AvBD9（GST－AvBD9）融合蛋白常規(guī)免疫新西蘭大白兔，每次免疫劑量500μg，溶于PBS緩沖液中。首次與弗氏完全佐劑等體積混合，4℃磁力攪拌至蛋白質(zhì)呈乳狀，對新西蘭大白兔頸部及皮下多點(diǎn)注射；2周后以同樣的抗原劑量與弗氏不完全佐劑乳化后增強(qiáng)免疫；此后每隔10d免疫1次，共4次；最后1次以不含佐劑的抗原從耳靜脈免疫，7d后常規(guī)心臟取血，制備血清。

1.6 抗體效價的測定

間接酶聯(lián)免疫分析（ELISA）方法檢測抗體效價參照文獻(xiàn)［11］所述的方法，并進(jìn)行適當(dāng)修改。GST－AvBD9融合蛋白用包被液稀釋后包被酶標(biāo)板，待測孔分別加入1∶400稀釋的兔抗血清，用免疫GST－AvBD9蛋白前的兔血清作為陰性對照。二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶40 000稀釋），底物顯色劑為四甲基聯(lián)苯胺（TMB），用酶標(biāo)儀測定波長490nm處的吸光度值。

1.7 抗體特異性的檢測

取純化后的融合蛋白GST－AvBD9及空載體pGEX－6P－1表 達(dá) 蛋 白 樣 品 進(jìn) 行 SDS－PAGE 電 泳后，用半干法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜上，5%脫脂奶粉封閉后，以本試驗(yàn)制備的兔抗血清（1∶100稀釋）為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶16 000稀釋）為二抗進(jìn)行反應(yīng)。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）避光顯色10～15min，雙蒸水洗終止反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

EcoRⅠ、SalⅠ酶切后的載體pGEX－6P－1和目的基因AvBD9經(jīng)連接重組后獲得的重組質(zhì)粒pGEX6 P－AvBD9片段長度為5 100bp左右，基因AvBD9片段長度約200bp，如圖1。

圖1 重組質(zhì)粒pGEX6P－AvBD9酶切鑒定Fig.1 Identification of pGEX6P－AvBD9recombinant plasmid by restriction enzyme digestion

2.2 融合蛋白的純化

重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX－6P－AvBD9轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后菌體超聲破碎，取上清和沉淀分別進(jìn)行SDS－PAGE電泳，上清中幾乎無融合蛋白GST－AvBD9表達(dá)，證明融合蛋白GST－AvBD9以包涵體形式在宿主菌內(nèi)高效表達(dá)。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）標(biāo)簽蛋白分子質(zhì)量約為26ku，融合后的蛋白分子質(zhì)量約為34ku。試驗(yàn)中還嘗試17℃低溫，慢速160r/min過夜誘導(dǎo)融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，結(jié)果融合的目的蛋白仍以包涵體形式存在。試驗(yàn)中IPTG設(shè)置5個濃度梯度，溫度則分別設(shè)25、37℃2個梯度，經(jīng)SDS－PGFE電泳分析鑒定，從圖2可以看出，IPTG誘導(dǎo)濃度及溫度對融合蛋白GSTAvBD9表達(dá)量影響不大；GST標(biāo)簽蛋白分子質(zhì)量約為26ku，融合后的蛋白分子質(zhì)量約為34ku。試驗(yàn)中還嘗試17℃低溫，慢速160r/min過夜誘導(dǎo)融合蛋白在大腸桿菌種表達(dá)，結(jié)果融合的目的蛋白仍以包涵體形式存在。

圖2 重組質(zhì)粒pGEX6P－AvBD9融合表達(dá)蛋白的SDS－PAGE分析Fig.2 Analysis of GST－AvBD9recombinant plasmid fusion protein by SDS－PAGE

如圖3所示，經(jīng)SDS－PAGE檢測，純化后的目的融合蛋白在34ku處出現(xiàn)單一的目的蛋白條帶，與預(yù)期蛋白分子量相當(dāng)。在經(jīng)測定，純化后得到的融合蛋白濃度為1.8mg/mL。

2.3 抗體效價測定結(jié)果

免疫融合蛋白GST－AvBD9前的新西蘭大白兔血清為陰性對照，加強(qiáng)免疫后的新西蘭大白兔心臟采血，并立即將血液放入37℃恒溫箱1h，然后取出放入4℃冰箱2h，收集抗血清，－20℃保存?zhèn)溆?。?jīng)間接ELISA測定，選出最適包被濃度為5μg/mL，抗純化的融合蛋白GST－AvBD9的抗體滴度為38 400倍。

2.4 抗體免疫原性鑒定結(jié)果

對純化的融合蛋白GST－AvBD9及空載體pGEX－6P－1表達(dá)蛋白樣品進(jìn)行SDS－PAGE電泳，將凝膠上的目的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜中，并對NC膜進(jìn)行封閉、一抗、二抗孵育，然后用DAB顯色，結(jié)果在34ku處出現(xiàn)明顯的特異性雜交條帶（圖4），表明本試驗(yàn)制備的多克隆抗體具有免疫反應(yīng)性和蛋白特異性，同時也表明融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)獲得了成功。

圖3 純化GST－AvBD9及GST標(biāo)簽蛋白的SDS－PAGE分析Fig.3 Analysis of SDS－PAGE of purified GST－AvBD9and tag protein

圖4 GST－AvBD9融合蛋白的蛋白質(zhì)免疫印跡分析Fig.4 Western bolt analysis of GST－AvBD9fusion protein

3 討 論

防御素天然產(chǎn)量低，合成或從機(jī)體中提取步驟復(fù)雜且產(chǎn)量低。目前從原核表達(dá)、真核表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)等方面對防御素進(jìn)行研究已成為熱點(diǎn)。然而防御素多為小分子的堿性多肽，易受到蛋白酶的影響，而且表達(dá)產(chǎn)物往往對宿主細(xì)胞有毒性。因此，抗菌肽的外源表達(dá)存在很大的困難，目前主要是以融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)。

pGEX載體是原核表達(dá)中常用的載體，pGEX都帶有tac啟動子，實(shí)現(xiàn)了化學(xué)誘導(dǎo)的高水平表達(dá)。本試驗(yàn)選擇pGEX－6P－1載體，將AvBD9與GST融合表達(dá)，融合表達(dá)可降低抗菌肽對宿主菌的毒性，同時也保護(hù)目的蛋白不被蛋白酶水解。本研究中的融合蛋白在宿主細(xì)胞中大量表達(dá)，經(jīng)SDS－PAGE電泳分析后，發(fā)現(xiàn)融合蛋白以包涵體形式存在。為了獲取包涵體蛋白，首先要進(jìn)行細(xì)菌細(xì)胞破碎，菌體細(xì)胞破碎的方法有很多，較常用的有超聲波破碎、化學(xué)試劑及酶等的處理。細(xì)胞破碎不完全會影響包涵體的提取量，破碎過度會使包涵體蛋白降解［12］。本試驗(yàn)采用Merck公司的BugBuster蛋白抽提試劑進(jìn)行包涵體蛋白的純化，加入裂解液孵育后菌體基本完全破碎，且懸液不黏稠，可獲得純度較高的包涵體蛋白。本試驗(yàn)在大腸桿菌生長的指數(shù)期即OD600nm＝0.6時，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。IPTG的誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)溫度上分別設(shè)有梯度，經(jīng)SDS－PAGE電泳分析，不同濃度的IPTG誘導(dǎo)后，融合蛋白GST－AvBD9的表達(dá)量無明顯變化；且2個不同的誘導(dǎo)溫度作用下，目的蛋白表達(dá)量亦無明顯變化，均以包涵體形式存在。本試驗(yàn)還嘗試低溫17℃，低轉(zhuǎn)速120r/min過夜誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，經(jīng)SDS－PAGE電泳分析，融合蛋白仍以包涵體形式存在。試驗(yàn)中還嘗試?yán)脴?gòu)建PET－32a－AvBD9載 體，誘 導(dǎo) 表 達(dá) HIS－AvBD9 融合蛋白，但經(jīng)SDS－PAGE電泳檢測，誘導(dǎo)后宿主菌中不表達(dá)該融合蛋白。

AvBD9本身對大腸桿菌具有毒性，以包涵體形式在宿主菌內(nèi)表達(dá)是其最佳表達(dá)方式。但是包涵體蛋白的溶解及復(fù)性過程復(fù)雜，而未能充分溶解的帶GST標(biāo)簽蛋白不易與柱子結(jié)合，且回收率低。通過PreScission蛋白酶切除標(biāo)簽蛋白，過柱洗脫以獲得目的蛋白，但試驗(yàn)中酶切及過柱效果都不理想。因此采取切膠經(jīng)電洗脫獲得融合蛋白，該融合蛋白仍具有免疫原性，用于免疫新西蘭大白兔獲得抗GST－AvBD蛋白多克隆抗體。經(jīng)ELISA檢測表明抗GST－AvBD9的抗體滴度高達(dá)1∶38 400；利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）方法檢測表明，所獲得的多克隆抗體能與GSTAvBD9融合蛋白特異性結(jié)合。因此本試驗(yàn)所獲得的多克隆抗體可用于檢測AvBD9蛋白表達(dá)等相關(guān)試驗(yàn)，為進(jìn)一步研究AvBD9生物學(xué)功能以及從蛋白質(zhì)水平檢測AvBD9基因表達(dá)奠定了良好基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)利用基因工程的方法，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX6 P－AvBD9，在宿主菌中以包涵體蛋白形式進(jìn)行表達(dá)，通過切膠純化獲得GST－AvBD9融合蛋白，以表達(dá)GST－AvBD9融合蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，經(jīng)ELISA及 Western－blot方法檢測，獲得了具有較高抗體滴度及特異性良好的GST－AvBD9融合蛋白多克隆抗血清。

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