泛耐藥銅綠假單胞菌的毒力基因檢測(cè)和同源性分析

陳惠玲，盛 慧，葉惠芬，楊英為，楊一言，黃小媛，楊銀梅

銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染的重要病原菌，其致感染機(jī)制是通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)（typeⅢsecretion system，T3SS），以其效應(yīng)蛋白ExoU為主的毒力蛋白表達(dá)，可導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的凋亡，加重炎性反應(yīng)，增高感染病死率［1］。攜帶毒力基因的泛耐藥銅綠假單胞菌，給臨床銅綠假單胞菌感染的治療帶來了極大挑戰(zhàn)。因此，本研究對(duì)53株臨床分離的泛耐藥銅綠假單胞菌進(jìn)行毒力基因exoU和exoS檢測(cè)，并采用BOX－PCR指紋圖譜分析技術(shù)對(duì)醫(yī)院感染的泛耐藥銅綠假單胞菌進(jìn)行同源性分析，為醫(yī)院感染的控制與管理提供基因分型的病原學(xué)資料，為臨床抗感染治療提供依據(jù)。

材料與方法

一、材料

（一）菌株來源及分布 53株泛耐藥銅綠假單胞菌分離自2008年9月—2012年6月廣州市第一民醫(yī)院醫(yī)院感染患者的各種臨床標(biāo)本，剔除同一患者相同部位在1周內(nèi)檢出的重復(fù)菌株。其中纖維支氣管鏡吸痰標(biāo)本42株，傷口分泌物和中段尿標(biāo)本各3株，靜脈血標(biāo)本2株，腹水、膿液和膽汁各1株。菌株主要分布于重癥監(jiān)護(hù)病房27株，呼吸內(nèi)科11株，綜合病科7株，急診留觀病區(qū)和腦系外科各2株，血液內(nèi)科、燒傷外科、胃腸外科和鶴洞分院內(nèi)科各1株。

（二）儀器與試劑 VITEK2系統(tǒng)及API20E試劑均為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品；PCR儀為美國PE公司產(chǎn)品；電泳儀為美國BIO－RAD公司產(chǎn)品；成像系統(tǒng)為英國UVI凝膠成像系統(tǒng)；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；Premix Taq酶（Code No.：D334A）體系及 DNA Marker DL2000購自大連寶生物工程有限公司。

二、方法

（一）細(xì)菌鑒定及藥物敏感試驗(yàn) 采用常規(guī)方法分離細(xì)菌，用API 20NE或法國生物梅里埃公司VITEK2系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定且進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，結(jié)果參照CLSI 2009年版標(biāo)準(zhǔn)判讀［2］。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌 ATCC 25922、銅綠假單胞菌 ATCC 27853。

（二）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用WHONET5.6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

（三）細(xì)菌DNA的提取 采用煮沸法提取細(xì)菌總DNA，挑取一定量純培養(yǎng)菌落加入含適量蒸餾水的 EP管中，混勻后加熱煮沸，10 000 r／min冷凍離心2 min。另取1.5 mL的EP管，將離心后的上清液吸入新的EP管中，上清液即為細(xì)菌總DNA溶液，保存于－20℃冰箱中備用。

（四）PCR檢測(cè) 毒力基因exoS和exoU采用PCR法檢測(cè)，Premix Taq酶體系25μL，上下游引物各10 pmol，模板DNA4μL，用ddH2O補(bǔ)足至50μL。循環(huán)參數(shù)為，94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，62℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸10 min。取8μL PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。毒力基因引物序列和目的產(chǎn)物長度見表1。

（五）BOX－PCR檢測(cè)攜帶相關(guān)毒力基因菌株同源性 BOX－PCR引物BoxAR1序列為5′－CTACGGCAAGGCGACGCTGACG－3′［3］。BOX－PCR 反應(yīng)體系總體積為25μL，包括 Premix Taq 12.5μL、DNA模板1μL、引物1μL、滅菌蒸餾水補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性45 s，50℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸7 min。取8μL PCR產(chǎn)物，加2μL溴酚藍(lán)于80V電壓，2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳1 h后，0.5 mg／L溴乙錠溶液染色成像，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。應(yīng)用Quantity one軟件中的非加權(quán)配對(duì)算數(shù)平均法（UPGMA）構(gòu)建聚類分析圖，把相似度大于80%菌株劃分為同一個(gè)基因型，代表同一克隆株，相似度小于80%菌株為不同的基因型，代表不同的克隆株。

表1 檢測(cè)銅綠假單胞菌毒力基因exo U和exo S的引物Table 1 Sequence of the primers used for PCR amplification of virulence genes exoUand exoSin Pseudomonas aeruginosa

結(jié) 果

一、藥敏試驗(yàn)

53株銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物阿米卡星、頭孢他啶、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、慶大霉素、亞胺培南、妥布霉素、頭孢吡肟、左氧氟沙星、甲氧芐啶－磺胺甲口惡唑、哌拉西林－他唑巴坦、氨曲南均耐藥。

二、菌株毒力基因exoS和exoU檢測(cè)

電泳結(jié)果顯示，53株泛耐藥銅綠假單胞菌中，41株菌毒力基因exo S陽性，11株菌毒力基因exo U陽性。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)，其中40株為exo S＋／exo U－表型，占75.5%；10株為exo U＋／exo S－表型，占18.9%；1株為exo S＋／exo U＋表型，占1.9%；2株為exo S－／exo U－表型，占3.8%。exo S＋／exo U－和exo U＋／exo S－型主要分布在重癥監(jiān)護(hù)病房，分別為16株（16／40，40%）和8株（8／10，80%）。

三、攜帶相關(guān)毒力基因菌株同源性比較

部分BOX－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜見圖1。BOX－PCR和聚類圖軟件分析顯示，11株exoU＋的菌株可劃分為7個(gè)基因型，分別命名為U1～U7，41株exoS＋的菌株可劃分為24個(gè)基因型，分別命名為S1～S24。其中主要的基因型有U7、S12、S14、S22和S24型，見表2。U7型克隆3株，來源于2個(gè)不同的科室；S12和S14型克隆各3株，S22型克隆4株，均分別來源于3個(gè)不同的科室；S24型克隆4株，來源于呼吸內(nèi)科，其余均為獨(dú)立的基因型。

圖1 泛耐藥銅綠假單胞菌部分?jǐn)U增產(chǎn)物電泳圖Figure 1 Electrophoretic result of BOX－PCR in some pandrug－resistant Pseudomonas aeruginose strains

表2 泛耐藥銅綠假單胞菌BOX－PCR主要基因型的科室及毒力基因分布Table 2 Distribution of the BOX－PCR－based virulence genotypes of pandrug－resistant Pseudomonas aeruginosain different wards

討 論

銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染的重要病原菌，常呈多重耐藥或泛耐藥，治療棘手，病死率高，可造成一定程度的醫(yī)院感染流行［4－5］，因此泛耐藥銅綠假單胞菌為醫(yī)院感染的主要監(jiān)控對(duì)象。自1996年我國臺(tái)灣地區(qū)分離到第1株泛耐藥銅綠假單胞菌以來，世界上多個(gè)地區(qū)陸續(xù)有泛耐藥銅綠假單胞菌的報(bào)道［5］，我院3年多分離到53株泛耐藥銅綠假單胞菌，主要分布在重癥監(jiān)護(hù)病房和呼吸內(nèi)科，與這2個(gè)科室常年收治大量需機(jī)械通氣的危重患者，且大部分患者有嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病，免疫功能低下，頻繁使用留置導(dǎo)管等侵襲性操作有關(guān)。

T3SS是銅綠假單胞菌致病性的重要毒力系統(tǒng)，其中exoS和exoU的臨床意義尤為重要，Hauser等［6］研究顯示，exoU＋為細(xì)胞毒型基因，表達(dá)蛋白ExoU引起細(xì)胞壞死、凋亡，危害最大；exo S＋為侵襲型基因，表達(dá)蛋白exoS能抑制宿主細(xì)胞吞噬作用、破壞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排、導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞分裂等，感染相對(duì)較輕；exoU＋基因型的銅綠假單胞菌毒力更強(qiáng)，感染后癥狀更嚴(yán)重，患者病死率更高；T3SS陽性銅綠假單胞菌常以exo S＋／exo U－和exo U＋／exo S－基因型存在。本研究結(jié)果顯示，53株泛耐藥銅綠假單胞菌中，exo S＋／exo U－基因型菌40株，占75.5%；exo U＋／exo S－基因型菌10株，占18.9%，與卓超等［7］報(bào)道相似。另有1株為exo S＋／exo U＋表型，2株為exo S－／exo U－表型。攜帶毒力基因的銅綠假單胞菌主要分布在重癥監(jiān)護(hù)病房，以exo S＋／exo U－和exo U＋／exo S－基因型為主，且在重癥監(jiān)護(hù)病房exo U＋／exo S－基因型菌株的分離株為8株（8／10），明顯高于分離率為40%（16／40）的exo S＋／exo U－基因型。因此，對(duì)于攜帶毒力基因的泛耐藥銅綠假單胞菌，更應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)控，防止醫(yī)院感染暴發(fā)流行。

BOX插入因子為細(xì)菌基因組重復(fù)序列，大小為154 bp，由保守性不同的box A、box B和boxC等亞單位組成，其中只有box A存在細(xì)菌菌株、種、屬水平的分布差異及進(jìn)化過程中表現(xiàn)出多拷貝和高保守性，BOX－PCR技術(shù)則根據(jù)box A亞單位設(shè)計(jì)引物，使重復(fù)序列之間的不同基因區(qū)域得以選擇性擴(kuò)增，得到大小不等的DNA擴(kuò)增片段，最后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其多態(tài)性［3，8］。

BOX－PCR結(jié)果顯示，exoU＋菌株中，3株U7型克隆株來源于2個(gè)不同的科室，結(jié)合臨床資料，3株菌分離的時(shí)間相差較遠(yuǎn)，可排除該克隆株的院內(nèi)暴發(fā)流行。exoS＋菌株中，4株S24型克隆株均來源于呼吸內(nèi)科，雖是同年不同月份分離，仍提示S24型克隆株在呼吸內(nèi)科存在流行。因此，應(yīng)嚴(yán)格進(jìn)行消毒隔離，以避免該克隆株在科室，甚至醫(yī)院發(fā)生暴發(fā)流行。S12、S14型克隆各3株，S22型克隆4株，均來源于3個(gè)不同科室，且S14和S22型克隆株分離的時(shí)間相隔較遠(yuǎn)，故不存在這2型克隆株的院內(nèi)暴發(fā)流行，而S12型克隆株在同1個(gè)月發(fā)現(xiàn)，說明其在醫(yī)院內(nèi)存在小規(guī)模的流行?？咕幬锏拇罅渴褂檬菍?dǎo)致泛耐藥銅綠假單胞菌形成的主要原因，機(jī)械通氣等頻繁應(yīng)用的侵襲性治療手段容易因消毒不嚴(yán)格而導(dǎo)致泛耐藥銅綠假單胞菌的傳播，入住重癥監(jiān)護(hù)病房時(shí)間過長患者因病情嚴(yán)重，需接受更多的抗菌藥物及侵襲性治療措施，也易受泛耐藥銅綠假單胞菌感染［5，9］。3株S12型克隆株分別來源于重癥監(jiān)護(hù)病房、綜合病科和呼吸內(nèi)科，提示這些科室應(yīng)加強(qiáng)醫(yī)院感染的控制，合理應(yīng)用抗菌藥物，隔離感染的患者，加強(qiáng)醫(yī)護(hù)人員手衛(wèi)生和其他消毒隔離措施，并用BOX－PCR技術(shù)對(duì)泛耐藥銅綠假單胞菌感染進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，以防止暴發(fā)流行。

［1］ Hauser AR.The Type III secretion System of Pseudomonas aeruginosa：infection by injection［J］.Nat Rev Microbiol，2009，7（9）：654－665.

［2］ Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for Antimicrobial Susceptibility Testing［S］.19th Informational Supplement，2009，M100－S19.

［3］ Coenye T，Spilker T，Martin A，et al.Comparative assessment of genotyping methods for epidemiologic study of Burkholderia cepacia genomovar III［J］.J Clin Microbiol，2002，40（9）：3300－3307.

［4］ 趙祝香，陳惠玲，魏樹全，等.多藥耐藥銅綠假單胞菌耐藥性及相關(guān)耐藥基因分析［J］.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011，16（17）：1159－1162.

［5］ 魏樹全，趙子文，鐘維農(nóng)，等.泛耐藥銅綠假單胞菌肺炎危險(xiǎn)因素的病例對(duì)照研究［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2009，19（6）：673－676.

［6］ Hauser AR，Engel JN.Pseudomonas aeruginosainduces type－Ⅲ－secretion－mediated apoptosis of macrophages and epithelial cells［J］.Infect Immune，1999，67（10）：5530－5537.

［7］ 卓超，王露霞，肖書念，等.銅綠假單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)毒力基因的臨床意義［J］.中華燒傷雜志，2010，26（5）：354－359.

［8］ Versalovic J，Koeuth T，Lupski JR，et al.Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes［J］.Nucleic Acids Res，1991，19（24）：6823－6831.

［9］ 楊亞敏，李強(qiáng)，闞志超，等.泛耐藥菌預(yù)防與治療研究進(jìn)展［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，20（7）：1042－1044.