周秀玲，李知新，李 忠，趙 燕，田進(jìn)梅

（寧夏動物疾病預(yù)防控制中心，寧夏銀川 750002）

2012年9月11日，寧夏中衛(wèi)市移民新村養(yǎng)殖戶從外省某縣調(diào)入4～6月齡肉牛86頭，在調(diào)出地進(jìn)行了口蹄疫O型-Asia-I型雙價疫苗免疫，調(diào)入后7頭牛出現(xiàn)咳嗽、鼻孔流淡紅色黏液，經(jīng)當(dāng)?shù)孬F醫(yī)用青霉素、安痛定等藥物治療，效果不佳。至2012年9月25日，死亡9頭，其余均出現(xiàn)相似的臨床癥狀。剖解發(fā)現(xiàn)氣管和喉頭黏膜充血、出血，喉頭外膜和肌肉有米粒大小的出血點，肺臟出血、呈醬紫色、質(zhì)地松脆，胸腔有大量暗紅色積液。綜合臨床癥狀，病原分離鑒定及RT-PCR檢測，確診為牛支原體肺炎。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集 采集疫點疑似發(fā)病牛肺組織病變區(qū)3份，同群發(fā)病牛鼻腔棉拭子77份。采集非疫區(qū)健康牛鼻拭子5份。

1.2 材料與試劑 PCR擴(kuò)增儀為Biometra公司生產(chǎn)；紫外凝膠成像系統(tǒng)、核酸蛋白檢測儀、電泳儀均為Bio-Rad公司生產(chǎn)；PPLO肉粉為美國BD公司產(chǎn)品；瓊脂粉、酵母粉、馬血清、精氨酸、10×MEM為Gibco公司產(chǎn)品；葡萄糖為西安化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；青霉素為寧夏啟元藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；High pure Viral RNA Kit為Roche公司產(chǎn)品；PrimeScript One-Step RT-PCR kit Ver.2購自大連寶生物工程有限公司；Marker DL2000購自北京博邁德科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PPLO固體培養(yǎng)基的制備 按300 mL配制。取葡萄糖1.5 g、PPLO肉粉6.3 g、瓊脂粉4.5 g、酵母粉1.5 g，加三蒸水260 mL，121 MPa高壓20～25 min，待冷卻到40 ℃，加入馬血清30 mL、10%精氨酸6 mL、10×MEM 3 mL、8萬單位過濾青霉素3mL，混勻。25 mL倒一個培養(yǎng)基，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 牛支原體肺炎的培養(yǎng) 將無菌采集的肺臟組織，用pH7.2的PBS液按1:5比例勻漿，取200 uL上清液體涂板。5% CO2培養(yǎng)箱24～72 h。觀察并記錄結(jié)果。

1.3.3 引物 本實驗室保存。按照文獻(xiàn)[1，3]合成：P1：5'-TATTATTTTTGCATGAAAGTAATAT-3'，P2：5'-CGTCAAGGTAGCATCATTTC-3'。 預(yù) 計 產(chǎn)物大小為310 bp。

1.3.4 RNA提取

病毒總RNA按Roche公司High pure Viral RNA Kit試劑盒說明書提取。

1.3.5 目的基因的擴(kuò)增

一步法RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)組分為：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 mL，2×1 Step Buffer 12.5 mL，上游引物P1（10 pmol/mL）1 mL、下游引 物 P2（10pmol/mL）1 mL、模板 RNA 3 mL、Rnase-free Water 6.5 mL?？傮w系25 mL；反應(yīng)條件為：42 ℃ 40 min，95 ℃ 3 min，反應(yīng)參數(shù)：94 ℃30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物以2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 病原分離鑒定結(jié)果

對疑似牛肺臟組織接種支原體固體培養(yǎng)基，5%CO2培養(yǎng)箱24～72 h，可發(fā)現(xiàn)有典型“煎雞蛋”樣菌落。

2.2 RT-PCR檢測結(jié)果

對疑似患病牛肺臟組織和同群牛鼻拭子進(jìn)行牛支原體RT-PCR檢測，得到目的條帶，經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增出了大約310 bp的條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致。

3 討論與分析

據(jù)報道，牛呼吸系統(tǒng)病原混合感染中，牛支原體肺炎居首位[1]，可引起牛的肺炎、關(guān)節(jié)炎、中耳炎、腦膜炎等多種疾病[2]。1961年美國學(xué)者首次從患有乳房炎的病牛中分離到該病原[2]，該病在北美和亞歐等國引起廣泛傳播和蔓延，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-5]。中國2008年分離到該病原，隨后在我國16個省傳播和蔓延[6]。寧夏2009年由外調(diào)引進(jìn)該病，牛引進(jìn)本地后可迅速發(fā)病，并能引起同群本地牛發(fā)病，發(fā)病率可達(dá)100%，死亡率較高[3-4]。這表明隱性帶菌牛經(jīng)調(diào)運后進(jìn)入非疫區(qū)，不但能在短時間內(nèi)發(fā)病，而且能夠引起與其有接觸史的牛發(fā)病，如若不加控制，死亡數(shù)和感染數(shù)會急劇增加。

牛支原體肺炎檢測的常用方法有病原分離鑒定、ELISA和分子生物學(xué)檢測等。病原培養(yǎng)需要特殊條件，培養(yǎng)時間相對較長；目前在比利時、加拿大、瑞士等國家已有商品化的抗體ELISA試劑盒，檢測時間短，適合臨床大批量檢測。由于中國沒有相關(guān)牛支原體肺炎疫苗進(jìn)行防治，因此在調(diào)運牛之前，建議采用上述ELISA試劑盒頭頭檢測調(diào)運牛。對有疑似癥狀的牛建議采集牛鼻腔拭子或肺臟病變區(qū)，進(jìn)行分子生物學(xué)方法進(jìn)行檢測。發(fā)現(xiàn)陽性畜，應(yīng)及時隔離撲殺，嚴(yán)格對場地消毒，同時還應(yīng)對其他易感牛及時檢測，從而達(dá)到有效的預(yù)防和控制作用。

[1]張永強，張 維，王清華，等.牛支原體肺炎流行RT-PCR方法的初步診斷[J].中國動物檢疫，2011，28（6）：48-49.

[2]Nicholas R A，Ayling R D. Mycoplasma bovis：diagnosis and control[J]. Res Vet Sci，2003，74（2）：105-112.

[3]李知新，王進(jìn)香，閆小芹，等.寧夏牛支原體肺炎RT-PCR方法的診斷[J].中國動物檢疫，2012，29（1）：44-45.

[4]王曉亮，李知新，王進(jìn)香，等.寧夏牛傳染性牛支原體肺炎的血清學(xué)調(diào)查[J].中國動物檢疫，2011，28（6）：56-57.

[5]石 磊，龔 瑞，尹爭艷，等.肉牛傳染性支原體肺炎流行的診斷[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，27（5）：629-633.

[6]李 媛，董 慧，張美晶，等.牛霉形體PCR檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2009，39（5）：416-420.