魏亞松，鄒 玲，溫建新，劉文華，邵 嶧

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.青島安普動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)品制造有限公司，山東青島 266061）

長(zhǎng)期以來，飼料中添加抗生素等添加劑雖對(duì)預(yù)防畜禽疾病有明顯的作用，但隨著抗生素的普及甚至濫用，造成病菌產(chǎn)生耐藥性、藥物殘留及環(huán)境污染等諸多不利影響，直接危害人類健康。在這種情況下，益生菌作為一種無毒、無害、無殘留、無抗藥性的綠色飼料添加劑，就已成為動(dòng)物疾病防治的一個(gè)新方向[1]。歐洲許多國(guó)家已禁止使用抗生素作為促生長(zhǎng)劑，因此尋求無毒副作用、無藥物殘留的微生態(tài)飼料添加劑已成為研究熱點(diǎn)[2-3]。

枯草芽孢桿菌是農(nóng)業(yè)部允許作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一，其制劑為無毒、無殘留、無污染的綠色添加劑。據(jù)雷愛瑩等報(bào)道[4]其具有改善消化道內(nèi)環(huán)境、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高動(dòng)物機(jī)體免疫力及產(chǎn)生多種酶類、提高消化酶活性等功能而備受青睞，故具有廣闊的發(fā)展前景。據(jù)李俊波報(bào)道[5]在蛋雞日糧中添加枯草芽孢桿菌制劑具有改善料蛋比、降低死淘率和雞蛋破損率，并且顯著提高了日糧粗蛋白和有機(jī)物消化率。溫海燕和雷愛瑩等報(bào)道[3-4]其在飼料添加劑、污水處理、疫苗載體等各方面已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，顯示了巨大的社會(huì)效益和生態(tài)效益。

枯草芽孢桿菌在養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)揮巨大作用，已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用[6]。大部分都是針對(duì)雞、豬、水產(chǎn)等的，很少見有資料報(bào)道在水貂等特種經(jīng)濟(jì)毛皮動(dòng)物中。本試驗(yàn)從健康水貂腸道中分離鑒定枯草芽孢桿菌，以期為進(jìn)一步深入研究提供參考，并為水貂等毛皮動(dòng)物的微生態(tài)制劑應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 健康成年丹麥紅眼母貂。

1.1.2 培養(yǎng)基 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)公司。

1.1.3 主要試劑 革蘭氏染色液、5%孔雀綠染液、0.5%沙黃溶液、糖醇發(fā)酵管（葡、麥、蔗、乳、甘、木、果、七葉苷等）、硝酸鹽還原試驗(yàn)甲液和乙液、3%過氧化氫、明膠、碘液等。DNA提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；TE緩沖液，Premixed Taq（incl dye）、DL 2000 DNA Marker、電泳級(jí)瓊脂糖Agarose Regular購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.1.4 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱、恒溫振蕩器、高壓蒸氣滅菌鍋、光學(xué)顯微鏡、電子天平、DYY-Ⅲ-7型電泳儀、AlphaView S A凝膠成像分析儀和721型紫外分光光度計(jì)等。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集與處理 取腸黏膜和糞便樣品1 g，置于含有PBS緩沖液的三角瓶（含玻璃珠）中，取上清液加入離心管離心，2000 r/min離心10 min，置于80℃的水浴鍋內(nèi)水浴30 min[7-8]。

1.2.2 菌株的分離純化 取菌液接種于普通培養(yǎng)基平板上，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18 h；挑取疑似菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。

在折騰了兩天以后，我被三根高大杉木支起的一個(gè)葫蘆瓜子滑輪牽引扯出了地面。他們鋸掉我四周伸張的樹根，把帶土的根部用草要子纏繞包裹起來，并在上面灑了水，以保持我基本的生存需求。

1.3 染色鏡檢

1.3.1 革蘭氏染色 挑取單菌落，在載玻片上進(jìn)行抹片，待其干燥固定后，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。

1.3.2 芽孢染色 挑取單菌落，抹片經(jīng)火焰固定后滴加5%孔雀綠水溶液加熱30～60 s使其產(chǎn)生蒸汽4次，水洗；滴加0.5%沙黃液1 min，水洗吸干鏡檢[9]。

1.4 生理生化試驗(yàn) 按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法[9-10]對(duì)分離菌進(jìn)行糖苷醇發(fā)酵試驗(yàn)、甲基紅（MR）試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（VP試驗(yàn)）、淀粉水解試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、TSI試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)等生理生化試驗(yàn)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，觀察結(jié)果。

1.5 16 S rRNA的PCR擴(kuò)增和序列分析

將分離的菌株接種于5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)，取4 mL菌液10000 r/min離心2 min，參考《精編分子生物學(xué)室驗(yàn)指南》[11]的方法提取DNA。

在參考了國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)[12-14]后，確定一對(duì)芽孢桿菌屬特異性引物：正向引物Primer A：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'，反向引物Primer B：5'-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3'，由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后，送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用DNAStar7.1軟件包中的SeqMan進(jìn)行序列拼接。采用BLAST和與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄的芽孢桿菌屬16 S rRNA的序列比對(duì)，并使用MegAlian中的Clustal X Method進(jìn)行同源性比較[16-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)和菌體形態(tài)結(jié)果

將從健康水貂腸道中分離的菌命名為P2。菌落呈灰白色、無光澤，表面粗糙，菌落邊緣不整齊，為干燥型菌落（圖1a）。革蘭氏染色為陽(yáng)性，菌體呈長(zhǎng)桿狀，芽孢中生，橢圓形（圖1b）。芽孢染色，芽孢被染成綠色，菌體呈紅色（圖1c）。

2.2 生理生化試驗(yàn)結(jié)果

分離菌P2的生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表1。

根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[18]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[19]，上述結(jié)果均符合枯草芽孢桿菌的生化特性，證明分離菌為枯草芽孢桿菌。

表1 P2菌的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 PCR鑒定結(jié)果 對(duì)菌株P(guān)2進(jìn)行芽孢桿菌屬的PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示有特異性條帶（圖2），證明菌株P(guān)2為芽孢桿菌屬。

將分離的P2菌株與其他14個(gè)從GenBank下載的國(guó)內(nèi)外分離的芽孢桿菌屬的基因序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果顯示比對(duì)的幾個(gè)菌株的同源性均在99.0%～99.9%之間（圖3）。由圖3可知，P2菌株的核酸序列與Bacillus subtilis strain CICC 10023（GU980947.1）的同源性最高，達(dá)到了99.9%，因此該菌株被鑒定為枯草芽孢桿菌。

3 討論

芽孢是某些革蘭氏陽(yáng)性菌在一些不適宜的條件下，在菌體內(nèi)形成的一個(gè)圓形或卵圓形的休眠體。所以本試驗(yàn)采用將樣品進(jìn)行80 ℃高溫處理30 min，然后進(jìn)行分離篩選。此外，本試驗(yàn)?zāi)z電泳結(jié)果比預(yù)期的偏大些，但是PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果卻與預(yù)期擴(kuò)增片段相符，這說明不能僅通過凝膠電泳圖來判斷結(jié)果，還需通過測(cè)序及序列分析確定結(jié)果。

本試驗(yàn)通過菌落形態(tài)觀察、革蘭染色、芽胞染色和生理生化特性方法對(duì)分離菌株的鑒定，與張紅英等[20]從人工飼養(yǎng)的健康三黃肉雞的盲腸和大腸中分離出了枯草芽胞桿菌的結(jié)果一致；本試驗(yàn)通過16S rRNA序列分析對(duì)分離菌株P(guān)2與從GenBank下載的國(guó)內(nèi)外分離的芽孢桿菌屬進(jìn)行核酸序列的同源性比較，結(jié)果顯示比對(duì)的幾個(gè)菌株的同源性均在99.0%～99.9%之間；與周宏璐等[21]通過16S rDNA序列分析對(duì)從養(yǎng)豬場(chǎng)健康成年豬糞便中分離的1株芽孢桿菌進(jìn)行鑒定，序列分析與枯草芽孢桿菌相似度為98.99%的結(jié)果相符。但在水貂腸道中，分離出枯草芽孢桿菌的報(bào)道尚屬首次。

枯草芽孢桿菌廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)，芽孢桿菌被制為活菌制劑已廣泛應(yīng)用于豬和家禽等動(dòng)物以及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，但在毛皮動(dòng)物特別是水貂養(yǎng)殖上，應(yīng)用研究相對(duì)較少?？莶菅挎邨U菌在大多數(shù)動(dòng)物腸道中被認(rèn)為是過路菌[22]，但在水貂腸道中分離出該菌，說明該菌對(duì)水貂有一定作用，具體機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究從健康水貂的腸道中分離純化出1株枯草芽孢桿菌，命名為P2，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)以及16 S rRNA序列分析進(jìn)行綜合鑒定。結(jié)果表明P2菌株菌落呈灰白色、邊緣不整齊；革蘭氏染色為陽(yáng)性，菌體呈長(zhǎng)桿狀，芽孢中生，橢圓形；能夠發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖等多種碳源；通過對(duì)菌株的擴(kuò)增、測(cè)序和分析可知，顯示菌株P(guān)2與菌株 Bacillus subtilis CICC 10023（GU980947.1） 親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)到了99.9%，因此鑒定P2菌株為枯草芽孢桿菌。

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