焦 慧，張 志，馬清華，付 偉

1遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧錦州 121001；2遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧錦州 121001

細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞中普遍存在的生命現(xiàn)象，低水平自噬對(duì)心肌細(xì)胞起保護(hù)作用，而高水平或持久的自噬則加重細(xì)胞損傷導(dǎo)致細(xì)胞死亡。如何適時(shí)有效地抑制自噬，減輕心肌損害，已成為心血管疾病的研究熱點(diǎn)。Apelin是Tatemoto等[1]利用反向藥理學(xué)方法從牛胃分泌物中提取并純化的孤兒G蛋白偶聯(lián)受體(血管緊張素1型受體相關(guān)蛋白APJ)的內(nèi)源性配體，在體內(nèi)廣泛分布，尤其在心血管系統(tǒng)高度表達(dá)，具有降低血壓、改善心臟功能、減小心肌缺血再灌注損傷[2]及抑制心肌細(xì)胞凋亡[3]等多種心肌保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，Apelin亞型之一Apelin-13還具有抑制心肌細(xì)胞自噬的作用[4]，但其作用機(jī)制尚未得到證實(shí)。本研究通過(guò)葡萄糖剝奪建立體外乳鼠心肌細(xì)胞自噬模型，在細(xì)胞水平上觀察Apelin-13對(duì)自噬的影響，進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。

材料和方法

1 主要試劑及藥品 DMEM：F12(1∶1)培養(yǎng)基、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)、PBS平衡鹽溶液(Hyclone公司)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)；胰蛋白酶(Byotime公司)；Apelin-13(北京康肽生物科技有限公司)，Tricribine、抗磷酸酪氨酸抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，兔抗人β-actin抗體、兔抗人LC3抗體、兔抗人Akt抗體、兔抗人p-Akt(Ser473)抗體、兔抗人mTOR抗體及兔抗人p-mTOR(Ser2448)抗體(Cell Signaling Technology公司)。

2 心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 標(biāo)本取自出生1~3 d的Sprague-Dawley(SD)乳鼠(遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，無(wú)菌條件下，取出生乳鼠的心臟，用PBS平衡鹽溶液清洗3次后剪成1 mm3大小，用濃度為0.06%的胰蛋白酶于37℃恒溫磁力攪拌器中分次消化，每次6~10 min至消化完全，小牛血清終止消化。收集的細(xì)胞懸液以1 200 r/min，10 min離心，加入含15%小牛血清的DMEM∶F12(1∶1)培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，接種于25 cm3的培養(yǎng)瓶中，每組設(shè)6個(gè)平行組，置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中，靜置90 min。吸出細(xì)胞懸液并加入0.1 mol/L的5-溴脫氧尿核苷(BrDU)，混勻?qū)⒓?xì)胞懸液稀釋成5×105/ml的細(xì)胞密度，接種于培養(yǎng)瓶，繼續(xù)置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h換液1次。連續(xù)培養(yǎng)72 h后，選擇生長(zhǎng)良好、搏動(dòng)規(guī)律的細(xì)胞進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。采用肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(α-Sarcomeric actin)進(jìn)行心肌細(xì)胞鑒定。

3 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立 將上述培養(yǎng)72 h的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為5組。1)正常對(duì)照組(Control組)：在其他組不同時(shí)間加入不同干預(yù)因素時(shí)，加入與干預(yù)因素等量的培養(yǎng)基，然后繼續(xù)按原培養(yǎng)基換液，培養(yǎng)12 h；2)葡萄糖剝奪組(GD組)：細(xì)胞換液前，操作同正常對(duì)照組，然后更換不含糖的DMEM∶F12(1∶1)培養(yǎng)基，建立葡萄糖剝奪誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞自噬模型，繼續(xù)培養(yǎng)12 h；3)Apelin-13預(yù)處理組(GD+Apelin-13組)：培養(yǎng)基中加入終濃度為1μmol/L的Apelin-13預(yù)處理30 min，其后同GD組；4)Tricribine+Apelin-13預(yù)處理組(GD+Tricribine+Apelin-13組)：培養(yǎng)基中加入終濃度為1μmol/L的Tricribine 30 min后，處理同GD+Apelin-13組；5)阻斷劑組(Tricribine組)：培養(yǎng)基中加入終濃度為1μmol/L的Tricribine 30 min后，處理同正常對(duì)照組。

4 透射電鏡下觀察自噬體 心肌細(xì)胞經(jīng)上述處理后，吸去培養(yǎng)液后用PBS緩沖液輕柔洗滌3遍，細(xì)胞刮刮取細(xì)胞移入離心管，1 600 r/min離心30 min，仔細(xì)吸棄上清后得到細(xì)胞團(tuán)塊，3%戊二醛及1%鋨酸雙重固定共3 h，PBS緩沖液漂洗30 min后，乙醇、丙醇逐漸脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，解剖顯微鏡下修塊，切片厚度1μm，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色。在透射電鏡下觀察心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，選取典型視野拍照。觀察心肌細(xì)胞自噬體的形態(tài)及數(shù)量變化。

5 免疫沉淀脂質(zhì)激酶分析法測(cè)PI3K活性 提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，加入抗-磷酸酪氨酸抗體，孵育1 h后，加入G蛋白包被的瓊脂糖珠懸液繼續(xù)孵育4~12 h。充分洗滌G蛋白包被的瓊脂糖珠后，再用PI3K分析緩沖液洗滌1次。經(jīng)洗滌過(guò)的抗原-抗體復(fù)合物加入50μl PI3K分析緩沖液，20μl脂質(zhì)底物的混合液進(jìn)行預(yù)孵育，加入10μl γ32PATP混合劑進(jìn)行酶反應(yīng)。10 min后加入等體積終止液終止反應(yīng)，用磷酸化的脂類(lèi)用氯仿-甲醇(1∶1)抽提2次，進(jìn)行薄層層析及放射自顯影。采用FJ-2115型自動(dòng)液體閃爍計(jì)數(shù)儀檢測(cè)放射性活度，以正常對(duì)照組平均放射性活度為100%標(biāo)準(zhǔn)，各組之間進(jìn)行比較。

6 Western-blotting法檢測(cè)心肌細(xì)胞LC3、Akt、p-Akt、mTOR與p-mTOR的蛋白表達(dá)水平 所收集心肌細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗滌2次，加入適量細(xì)胞裂解液，輕輕反復(fù)吹打混勻，冰上裂解20 min后，4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清為總蛋白，用BCA法行蛋白定量。在各組樣品中取總蛋白50μg上樣，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法行蛋白轉(zhuǎn)膜，5% BSA-PBST室溫封閉1 h。LC3、Akt、p-Akt、mTOR及 p-mTOR和 β-actin一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h。經(jīng)洗滌、顯影、灰度掃描后，以目的條帶和內(nèi)參條帶β-actin的灰度比值分別表示Akt、p-Akt、mTOR及p-mTOR的蛋白表達(dá)水平。LC3是自噬標(biāo)志性蛋白，有Ⅰ型和Ⅱ型之分，當(dāng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬發(fā)生時(shí)，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化明顯增加，因此常用目的條帶LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比值間接比較自噬率的多少。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 透射電鏡下觀察自噬體 自噬體表現(xiàn)為包繞廢棄胞漿成分的雙層膜結(jié)構(gòu)，發(fā)生自噬的細(xì)胞可見(jiàn)損傷的細(xì)胞器如線(xiàn)粒體的腫脹變性等，自噬體進(jìn)一步與溶酶體融合、消化，可表現(xiàn)為空泡樣結(jié)構(gòu)[5]。在相同單位視野下，GD組細(xì)胞內(nèi)自噬體及空泡樣結(jié)構(gòu)較正常對(duì)照組明顯增多；Apelin-13預(yù)處理后自噬體及空泡樣結(jié)構(gòu)較GD組明顯減少；而Apelin-13聯(lián)合應(yīng)用Tricribine后，自噬體及空泡樣結(jié)構(gòu)較Apelin-13預(yù)處理組顯著增多；單獨(dú)阻斷劑組與正常對(duì)照組自噬體及空泡樣結(jié)構(gòu)數(shù)量無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖1。

2 LC3的表達(dá)水平 與正常對(duì)照組相比，GD組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明顯增加(P＜0.01)；與GD組相比，GD+Apelin-13組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明顯下降(P＜0.01)；與GD+Apelin-13組相比，GD+Apelin-13+Tricribine組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明顯增加(P＜0.01)；Tricribine組與正常對(duì)照組相比，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖2。

圖1 透射電鏡下觀察心肌細(xì)胞內(nèi)的自噬體(×8 000)箭頭所示：為包繞廢棄胞漿成分的自噬體； N：細(xì)胞核Fig.1 Transmission electron microscopy showing autophagosomes of cardiomyocytes in control group (A), GD group (B), GD+apelin-13 group(C), GD+apelin-13+tricribine group (D), ticribine group (E) (×8 000)Arrows indicate the autophagosomes wrapping cytoplasmic components. N: nuclei

圖2 Western-blotting法檢測(cè) LC3蛋白表達(dá)水平Fig.2 Western-blot showing LC3 protein expression level in control group 1), GD group 2), GD+apelin-13 group 3), GD+apelin-13+tricribine group 4), ticribine group 5)aP＜0.01, vs control group; bP＜0.01, vs GD group; cP＜0.01,vs GD+apelin-13 group; dP＞0.05, vs control group

圖3 各組與對(duì)照組PI3K活性比較Fig.3 PI3K activity in control group 1), GD group 2), GD+apelin-13 group 3), GD+apelin-13+tricribine group 4), ticribine group 5)aP＜0.01, vs GD group

圖4 Western-blotting法檢測(cè)p-Akt與p-mTOR蛋白表達(dá)水平Fig.4 Western-blot showing expression level of p-Akt and p-mTOR protein in control group 1), GD group 2), GD+apelin-13 group 3),GD+apelin-13+tricribine group 4), ticribine group 5)aP＜0.01, vs GD group; bP＜0.01, vs GD+apelin-13 group

3 各組與對(duì)照組PI3K活性比較 與正常對(duì)照組(100%)相比，GD+Apelin-13組與GD+Tricribine+Apelin-13組PI3K的活性分別升高至159.72%、156.89%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；其余3組與正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖3。

4 通 路 蛋 白 Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的 表 達(dá)水平 葡萄糖剝奪的心肌細(xì)胞使p-Akt、p-mTOR的表達(dá)略有下降，但與正常對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；Apelin-13預(yù)處理30 min可明顯提高Akt與mTOR的磷酸化水平(P＜0.01)；而Apelin-13聯(lián)合應(yīng)用Tricribine后Akt與mTOR的磷酸化水平又被顯著下調(diào)(P＜0.01)；另外，各組心肌細(xì)胞中總Akt與總mTOR蛋白表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖4。

討 論

細(xì)胞自噬廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，正常情況下，自噬維持在一個(gè)較低的水平。在缺血缺氧、養(yǎng)分缺失、氧化應(yīng)激或感染等因素刺激下，細(xì)胞可啟動(dòng)自噬來(lái)清除受損的細(xì)胞器，對(duì)細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用，但是過(guò)度的激活自噬可導(dǎo)致細(xì)胞的死亡-Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡[6]。因此適時(shí)干預(yù)自噬現(xiàn)象，可有效阻止受傷細(xì)胞向不可逆損傷方向發(fā)展。本研究中，我們用無(wú)糖無(wú)血清的培養(yǎng)基進(jìn)行葡萄糖剝奪以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生自噬[7]。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Apelin-13可以明顯抑制GD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬，并且具有濃度依賴(lài)性，在1μmol/L時(shí)效果最佳[4]。近期研究還發(fā)現(xiàn)，Apelin-13可以通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮抑制急性缺血誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[8]。因此，本研究我們選用1μmol/L濃度的Apelin-13進(jìn)行預(yù)處理，之前30 min給予Akt抑制劑Tricribine抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，觀察心肌細(xì)胞自噬及通路相關(guān)蛋白的變化，從而探討Apelin-13是否也可通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞自噬的發(fā)生。

研究證實(shí)，電子顯微鏡下觀察到自噬體是自噬發(fā)生的金標(biāo)準(zhǔn)[9]。另外，LC3是重要的自噬相關(guān)蛋白，有Ⅰ型和Ⅱ型之分，未發(fā)生自噬時(shí)，細(xì)胞內(nèi)合成的LC3經(jīng)過(guò)加工，成為細(xì)胞質(zhì)可溶性的Ⅰ型LC3，當(dāng)發(fā)生自噬時(shí)，LC3-Ⅰ經(jīng)泛素樣加工修飾過(guò)程，與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合，形成Ⅱ型LC3。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值與自噬體的數(shù)量呈正相關(guān)[10]。本研究表明：葡萄糖剝奪后乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量顯著增多，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明顯升高，表明心肌細(xì)胞自噬模型成功建立，與Matsui等[7]的研究結(jié)果一致；外源給予Apelin-13后，發(fā)現(xiàn)可以拮抗葡萄糖剝奪引起的自噬體增多及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，說(shuō)明Apelin-13抑制了自噬的發(fā)生；而Akt特異性阻斷劑Tricribine則部分逆轉(zhuǎn)Apelin-13對(duì)心肌細(xì)胞自噬的改善；另外，單獨(dú)應(yīng)用Tricribine組與正常對(duì)照組相比，上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明1μmol/L濃度的Tricribine對(duì)心肌細(xì)胞自噬的影響較小。綜上提示我們，Apelin-13抑制心肌細(xì)胞自噬的作用可能與PI3K/Akt信號(hào)通路的激活相關(guān)。

自噬的發(fā)生機(jī)制主要包括：Ⅰ型PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、Ⅲ型P13K復(fù)合物及AMPK/eEF2激酶信號(hào)通路等，這些均參與調(diào)節(jié)自噬[11]。其中mTOR是一種進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與調(diào)控細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)條件改變時(shí)的反應(yīng)及與能量新陳代謝有關(guān)的許多調(diào)節(jié)通路，位于PI3K/Akt通路下游，是自噬的門(mén)控機(jī)制，起負(fù)性調(diào)節(jié)自噬的作用[12]。細(xì)胞外受體的激活可使受體酪氨酸激酶殘基磷酸化，磷酸化位點(diǎn)識(shí)別并結(jié)合PI3K的p85調(diào)節(jié)亞單位，使Ⅰ型PI3K激活，PI3K激活后產(chǎn)生的PIP2、PIP3可結(jié)合Akt，導(dǎo)致Akt的磷酸化，磷酸化的Akt激活下游信號(hào)分子mTOR，從而抑制自噬的發(fā)生。我們的研究發(fā)現(xiàn)：Apelin-13能明顯提高PI3K的活性，促進(jìn)Akt、mTOR磷酸化水平的升高；聯(lián)合給予阻斷劑Tricribine后，這種效應(yīng)部分被消除，提示Tricribine顯著下調(diào)了Apelin-13誘導(dǎo)p-Akt、p-mTOR蛋白的表達(dá)。上述自噬現(xiàn)象的變化支持了我們的假說(shuō)：Apelin-13激活了PI3K/Akt信號(hào)通路，同時(shí)激活其下游信號(hào)分子mTOR，發(fā)揮了抑制心肌細(xì)胞自噬的作用。然而在電鏡觀察與Western-blotting檢測(cè)中，我們發(fā)現(xiàn)：Tricribine抑制PI3K/Akt信號(hào)通路后，Apelin-13抑制自噬作用只是部分被消除，說(shuō)明尚有其他機(jī)制參與。因此，Apelin-13抑制自噬的過(guò)程部分是通過(guò)激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)的。

綜上所述，Apelin-13可以抑制細(xì)胞自噬，其機(jī)制是部分激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，抑制自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)及自噬體的形成，從而抑制損傷心肌細(xì)胞自噬的過(guò)度激活，提高心肌細(xì)胞的存活率。

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