吳七十三， 王青虎*， 劉 瑛， 代那音臺(tái)

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028000;2.通遼市高級(jí)技工學(xué)校，內(nèi)蒙古通遼 028000)

瑞香狼毒，蒙名為達(dá)琳圖日古，系瑞香科狼毒屬植物瑞香狼毒Stellera chamaejasmeLimt的干燥根，具有峻瀉，殺“粘”，消“奇哈”，止腐，消腫之功效。臨床用于肌、骨、脈“奇哈”癥，丹毒，乳癰，腮腫 (腮腺炎)，黃水瘡，痘瘡［1］。在我國大部分地區(qū)均有野生，廣泛分布于西北、內(nèi)蒙古、黑龍江等地?！毒е楸静荨罚?］、《蒙藥正典》［3］、《中國醫(yī)學(xué)百科全書·蒙醫(yī)學(xué)》［4］、 《識(shí)藥學(xué)》［5］認(rèn)為瑞香狼毒是瑞香科狼毒屬植物瑞香狼毒Stellera chamaejasmeLimt的干燥根，對形態(tài)和功效的描述與《蒙藥學(xué)》、《內(nèi)蒙古蒙藥材標(biāo)準(zhǔn)》所記載的相同。文獻(xiàn)報(bào)道瑞香狼毒主要的活性成分有黃酮類［6-9］、二萜 類［10］、香豆 素 類［11-15］以 及 木 脂 素類［16-17］等化合物。瑞香狼毒總黃酮提取物具有較強(qiáng)的體內(nèi)和體外抗腫瘤作用［18］，同時(shí)也是瑞香狼毒的主要有毒成分［19］，所以在傳統(tǒng)炮制的過程中，為減少有效成分的損失，降低毒性，中醫(yī)以醋炙的方法進(jìn)行炮制［20］，而蒙醫(yī)一直都有瑞香狼毒牛奶炮制、酒制和訶子湯炮制［21］的應(yīng)用，而且取得了顯著的成效。王晉等［22］提出瑞香狼毒奶制后毒性下降，但依然保持了良好的療效。查閱文獻(xiàn)，尚未見有對其有效成分和毒性成分多指標(biāo)成分同時(shí)定量分析的報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)以新狼毒素甲、瑞香素乙、新狼毒素乙為指標(biāo)成分，建立了HPLC同時(shí)測定方法并對瑞香狼毒及其奶制品中3種即為有效成分又是毒性成分進(jìn)行了比較。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 AUW220D型電子天平 (日本島津);HH—S26S型水浴鍋 (金壇市大地自動(dòng)化儀器廠);RE52—2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海瀘西分析儀器廠);KQ—100型系列超聲波沖洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);UV—2501PC型分光光度計(jì) (日本島津);高效液相色譜儀 (LC10—Atvp輸液泵，SPD—M10Avp檢 測 器，SCL—10Avp工 作 站，DGU—12A脫氣機(jī))。

1.2 試藥 瑞香狼毒采集于內(nèi)蒙古呼盟，由內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院蒙藥生藥教研室布和巴特爾教授鑒定為瑞香科狼毒屬植物瑞香狼毒Stellera chamaejasmeLimt的干燥根。新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙均自制并用高效液相色譜儀分別測定其純度均高于98.5%，可作為對照品使用;甲醇為色譜純 (天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);水為超純水;其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 大連依利特hypersil ODS2柱(300 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇和水梯度洗脫，梯度程序見表1;檢測波長293 nm;體積流量1.0 mL/min。在上述色譜條件下，新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙達(dá)到基線分離 (R＞1.5)，理論塔板數(shù)均不低于4 000，分離色譜圖見圖1。

表1 梯度程序Tab.1 Gradient elution program

圖1 樣品溶液 (A)和混合對照品溶液 (B)色譜圖Fig.1 Chromatograms of sample solution(A)and mixed reference substances(B)

2.2 炮制品的制備 取瑞香狼毒 (采集時(shí)間20100826)20 g，切成寬度約0.5 cm，放入燒杯中，加牛奶80 mL，浸泡5 h，加熱沸騰20 min，然后60℃烘干5.5 h，取出備用［22］。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 取新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，分別配成6.0 mg/mL的貯備液。

2.3.2 供試品溶液的制備 瑞香狼毒及其炮制品研細(xì)，稱取粗粉0.1 g，精密稱定，加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)充失質(zhì)量，過濾，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 檢測波長的選擇 分別取新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙的對照液，在200～400 nm內(nèi)，進(jìn)行掃描，根據(jù)掃描圖譜分析，確定新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙的檢測波長為293 nm。

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙對照品貯備液適量，分別加甲醇配制成5個(gè)不同質(zhì)量濃度的系列對照溶液。分別取上述溶液5 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程和線性范圍，結(jié)果見表2。

表2 3種有效成分的回歸方程式和最低檢測限Tab.2 Regression equation and detection limit of three effective components

2.4.3 最低檢測限 (LOQ) 取新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙對照品溶液以不同比例稀釋后測定，以信噪比2～3為最低檢出，結(jié)果見表2。

2.4.4 精密度試驗(yàn) 分別取同一新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙的對照品液，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。計(jì)算新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙的峰面積RSD，分別為0.98%、1.05%和0.89%。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于制備后0、4、6、8、12 h依法測定，以峰面積值計(jì)算新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙的峰面積RSD分別為1.22%、1.43%和1.12%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一采集時(shí)間的樣品6份，制備供試品溶液，進(jìn)行測定，計(jì)算新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其RSD分別1.33%、1.29%和1.02%。

2.4.7 回收率試驗(yàn) 精密稱取樣品 (采集時(shí)間為20100826)0.05 g，6份，精密加入新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙適量，制備供試品溶液，測定，計(jì)算加樣回收率和RSD，結(jié)果見表3。

表3 回收率測定結(jié)果 (n=6)Tab.3 Results of recoveries(n=6)

2.5 樣品測定 精密吸取3個(gè)不同采集時(shí)間的樣品供試品溶液和炮制品溶液3份，每份5 μL，進(jìn)樣測定，計(jì)算樣品中新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表4。

表4 測定結(jié)果 (n=5)Tab.4 Determination results(n=5)

3 討論

3.1 黃酮類成分是瑞香狼毒中含有量較大的一類成分，具有較強(qiáng)的體內(nèi)和體外抗腫瘤作用，也是主要有毒成分。瑞香狼毒牛奶炮制是現(xiàn)代蒙醫(yī)臨床上常用的炮制方法，經(jīng)文獻(xiàn)查閱，尚未見關(guān)于奶制對瑞香狼毒中黃酮類化合物影響的報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用HPLC建立了同時(shí)測定3個(gè)即為有效成分又是毒性成分的方法，對比了瑞香狼毒生品、奶制品中3個(gè)指標(biāo)成分的含有量差別，從而探討瑞香狼毒奶制對黃酮類成分的影響和減毒的機(jī)理。結(jié)果顯示，奶制對瑞香狼毒黃酮類成分影響明顯。其中，新狼毒素甲、瑞香素乙的含有量明顯降低，新狼毒素乙檢測不到。這說明牛奶炮制可降低瑞香狼毒中毒性成分，提高安全性。關(guān)于牛奶炮制能降低瑞香狼毒中黃酮類成分的原因有待于進(jìn)一步研究。

3.2 在流動(dòng)相選擇中，曾采用甲醇-水的不同梯度洗脫系統(tǒng)，結(jié)果甲醇-水梯度洗脫 (0～10 min，甲醇比例為28%遞升至45%，10～20 min，由甲醇腈比例45%遞升至65%，20～30 min，甲醇比例由65%遞升至 755%，30～40 min，甲醇比例為75%)，分離效果好，重現(xiàn)性強(qiáng)，可同時(shí)檢測到新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙且各成分均達(dá)到基線分離。經(jīng)紫外掃描可知，新狼毒素甲、瑞香素乙和新狼毒素乙均在261和293 nm處有最大吸收，并且293 nm吸收強(qiáng)度強(qiáng)，故選擇293 nm為檢測波長。

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