Fzr1基因沉默促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲與增殖

張保平，鐘 婷，張 莉，況海斌

(南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，江西南昌330006)

胚胎的正常發(fā)育依賴于功能性胎盤的形成，在胎盤發(fā)育的過程中，滋養(yǎng)層細(xì)胞的生長與侵襲受機(jī)體嚴(yán)格的時空性調(diào)節(jié)［1］。在妊娠早期，如滋養(yǎng)層細(xì)胞生長發(fā)育差，侵入不足，將導(dǎo)致早期流產(chǎn)、先兆子癇以及胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩等疾?。?］;如增生過度、侵入失控，正常滋養(yǎng)層細(xì)胞將轉(zhuǎn)化為絨毛膜上皮癌［3］，而有關(guān)其具體的調(diào)節(jié)過程不詳。

細(xì)胞周期末期促進(jìn)復(fù)合物(anaphase promoting complex，APC)與其調(diào)節(jié)亞基Fzr1是泛素蛋白酶小體系統(tǒng)中的一種細(xì)胞內(nèi)泛素連接酶E3，在增殖細(xì)胞中通過泛素化，降解特定的底物蛋白調(diào)控細(xì)胞周期的作用［4］。最近有研究顯示，F(xiàn)zr1基因敲除后，在妊娠9.5～10.5 d產(chǎn)生胚胎死亡，胎盤出現(xiàn)發(fā)育障礙［5－6］。另外，還表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)的干細(xì)胞增殖增強(qiáng)，自發(fā)性腫瘤(如乳腺瘤，脂肪腺瘤，睪丸癌，纖維腺瘤，肺癌等)的發(fā)生率明顯增加［5－6］。這些均提示，F(xiàn)zr1基因與胎盤發(fā)育相關(guān)，然而有關(guān)其在胎盤發(fā)育過程中時空性表達(dá)變化及其對滋養(yǎng)層細(xì)胞增生和侵襲的影響未見相關(guān)的報道。本研究擬探討Fzr1對JAR滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

FD培養(yǎng)基(Hyclone公司)，Matrigel(BD公司)，兔抗 Fzr1抗體(Invitrogen公司)，抗 Actin抗體、Fzr1 siRNA(sc-44349)、siRNA Transfection Reagent(sc-29528)及Control siRNA(sc-36869)(SANTA CRUZ公司)，HRP標(biāo)記的二抗(中杉生物公司)。

1.2 妊娠早期和晚期胎盤標(biāo)本

人妊娠早期(6～9周)絨毛樣本(共20例)，取自正常妊娠的真空負(fù)壓抽吸人工流產(chǎn)材料，妊娠晚期胎盤取自妊娠足月(34～38周)胎盤(共15例)。標(biāo)本取出后，立即送實(shí)驗(yàn)室，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗，一部分材料固定于Bouin's氏液中，用于免疫組化。另外一部分標(biāo)本暫貯存于－80℃，用于免疫印跡檢測。所有標(biāo)本均來自于南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，且獲得該單位倫理委員會的批準(zhǔn)和患者的知情同意。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及RNA干擾

JAR滋養(yǎng)層細(xì)胞系(上海細(xì)胞庫)培養(yǎng)于FD培養(yǎng)液中，細(xì)胞以2×105個/孔種植于6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞長至60% ～80%匯合時，用于Fzr1 RNA干擾。轉(zhuǎn)染開始時，溶液A的制備:取8 μLsiRNA加入到100 μL siRNA Transfection Medium;溶液B 的制備:取 8 μL siRNA Transfection Reagent加 入 到100 μL siRNA Transfection Medium，然后100 μL溶液A 和100 μL溶液B 混合，室溫孵育30 min，用2 mL的siRNA Transfection Medium洗JAR滋養(yǎng)層細(xì)胞1次，然后加入0.8 mL siRNA Transfection Medium到孵育后的溶液A和B的混合液中，混勻，輕輕覆蓋于細(xì)胞，37℃孵育細(xì)胞5～7 h，清洗后細(xì)胞用于MTS和Transwell實(shí)驗(yàn)，分為空白對照組(僅加入相應(yīng)劑量的培養(yǎng)液)、無義干擾對照組(加入control siRNA)和Fzr1干擾組(加入Fzr1 siRNA)。

1.4 MTS法檢測細(xì)胞增殖

細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/mL，細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板;每孔培養(yǎng)液總量100 μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，后加入 MTS 20 μL，37 ℃ 1 h。然后用分光光度度計在490 nm波長測定其A值。

1.5 Transwell小室檢測滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力

侵襲小室上層預(yù)鋪上Matrigel，細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個/mL。取200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell上室，在小室底端加入800 μL含10% 胎牛血清的培養(yǎng)液，作為趨化劑。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，用棉簽擦去上室濾膜上的細(xì)胞，再用手術(shù)刀將膜切下，置于1∶1甲醇和丙酮中室溫固定10 min，后用蘇木素染核。再將膜貼于玻片上，滴上DABCO液，蓋上蓋玻片，然后再在Nikon正置顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照，隨機(jī)采用3～5個視野，計算遷移至濾膜背面的細(xì)胞數(shù)。

1.6 免疫組織化學(xué)

將上述處理的絨毛和胎盤標(biāo)本固定于Bouin's氏液中，經(jīng)逐步脫水后包埋于石蠟中。組織切片經(jīng)脫蠟、水化，浸入含3%H2O2中10 min及5%BSA室溫封閉30 min，再將切片加入兔抗人Fzr1一抗(1∶500)4℃過夜。切片經(jīng)過PBS沖洗3次后，加入的HRP標(biāo)記的二抗，后用DAB方法顯色。

圖1 免疫組化分析Fzr1蛋白在胎盤的定位Fig 1 Immunohistochemical localization of Fzr1 protein in human placenta

1.7 免疫印跡

組織樣品置于800 μL細(xì)胞裂解液(RIPA)充分裂解，然后在4℃，12 000 r/min離心10 min，收集上清，以BCA法測定蛋白質(zhì)含量。每孔上樣40 μg，蛋白樣品經(jīng)過12%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，隨后在5%脫脂奶粉/TBST中(pH 7.4)室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜。隨后用HRP標(biāo)記的二抗于室溫孵育1 h，采用化學(xué)發(fā)光(ECL)方法進(jìn)行顯色，經(jīng)X線片曝光得到特異條帶。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Fzr1蛋白在正常妊娠胎盤的時空性表達(dá)

在妊娠早期，F(xiàn)zr1蛋白強(qiáng)烈表達(dá)于絨毛的細(xì)胞滋養(yǎng)層和合體滋養(yǎng)層細(xì)胞，陽性信號主要位于胞質(zhì)(圖1A，D)。在妊娠晚期，F(xiàn)zr1蛋白主要表達(dá)于絨毛的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞，且表達(dá)量明顯下降，陽性信號主要在細(xì)胞核(圖 1B，E)。與妊娠早期相比(0.83±0.12)，妊娠晚期Fzr1蛋白的相對吸光度值明顯下降(0.17±0.09，P ＜0.01)(圖2)。

2.2 Fzr1基因的干擾對JAR滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力的影響

圖2 Western blot檢測Fzr1蛋白在妊娠早期和晚期胎盤的表達(dá)Fig 2 Western blot analysis of Fzr1 protein expression in the placenta of first and third trimester

圖3 Transwell分析Fzr1 siRNA對JAR細(xì)胞侵襲的影響Fig 3 Effect of Fzr1 siRNA on the invasion of JAR cell by Transwell analysis(×200)

與空白對照相比，F(xiàn)zr1干擾組，JAR細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)(P＜0.01)(圖3A，C，D)，而無義對照，沒有明顯變化(圖3B，D)。

2.3 Fzr1基因的干擾對JAR滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖能力的影響

與空白對照相比，F(xiàn)zr1干擾組，JAR細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，而無義對照，沒有明顯變化(圖 4)。

圖4 MTS分析Fzr1 siRNA對JAR細(xì)胞增殖的影響Fig 4 Effect of Fzr1 siRNA on the proliferation of JAR cell by MTS analysis

3 討論

在正常情況下，細(xì)胞的生長依賴于細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的激活與降解，而其降解主要是通過泛素化途徑來實(shí)現(xiàn)的［4］。機(jī)體內(nèi)有兩種泛素-蛋白連接酶:SCF復(fù)合物(Skp1/Cullin/F-box protein complex，SCF)和APC［3］。其中APC與Fzr1蛋白結(jié)合才具有活性，激活的APC依賴泛素化降解周期蛋白B和其他蛋白質(zhì)，使M期激酶失活，從而調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)展。Fzr1基因的缺失或插入研究顯示，F(xiàn)zr1基因與胎盤的生長分化密切相關(guān)［6－7］，故本研究首先檢測了Fzr1蛋白在妊娠早晚期表達(dá)變化。在妊娠早期，F(xiàn)zr1蛋白強(qiáng)烈表達(dá)于絨毛的細(xì)胞滋養(yǎng)層和合體滋養(yǎng)層細(xì)胞，且表達(dá)水平比較高，至妊娠晚期，F(xiàn)zr1蛋白的表達(dá)量明顯下降，這一點(diǎn)與García-Higuera I等［6］對Fzr1 mRNA水平的研究相一致。

在妊娠的早期，絨毛的滋養(yǎng)層細(xì)胞具有高度的增殖能力和侵襲的特性，有利于絨毛組織在妊娠早期形成具有功能的胎盤和侵入子宮內(nèi)膜［3］。這一過程嚴(yán)格而又精細(xì)，受許多因素的調(diào)控［3，8－9］。滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖障礙或過度、浸潤過深或過淺，常導(dǎo)致各種疾病出現(xiàn)［1，3］。Fzr1蛋白在妊娠早期表達(dá)水平高，且已有的研究顯示其與細(xì)胞生長相關(guān)［5－6］，提示其可能與滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和侵襲有關(guān)。通過RNA干擾實(shí)驗(yàn)研究顯示，F(xiàn)zr1基因具有明顯抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和侵襲，有利于妊娠早期防止滋養(yǎng)層細(xì)胞過度增殖和侵入子宮內(nèi)膜，防止絨癌、葡萄胎等疾病的發(fā)生。至妊娠晚期，正常的滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和侵襲能力明顯下降，相應(yīng)的Fzr1蛋白表達(dá)水平明顯下降。

Fzr1蛋白對滋養(yǎng)層細(xì)胞的抑制作用可能與S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2，Skp2)的降解相關(guān)［10］。在增殖細(xì)胞中，F(xiàn)zr1蛋白與APC形成復(fù)合物，通過泛素化降解Skp2蛋白的表達(dá)，穩(wěn)定P27和P21的水平，抑制細(xì)胞增殖［10］。另外，APC也可通過轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β )抑 制 細(xì) 胞 增 殖［10－11］。TGF-β是一類調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與分化的多肽，對于滋養(yǎng)層細(xì)胞的生長和侵襲具有明顯的抑制作用［12］。Fzr1蛋白對于滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和侵襲的調(diào)節(jié)是否通過TGF-β來實(shí)現(xiàn)，有待于進(jìn)一步研究。

目前研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期、流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩以及絨癌和葡萄胎發(fā)生均與妊娠早期滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和侵襲相關(guān)［1－3］。在上述疾病中，F(xiàn)zr1蛋白表達(dá)量及表達(dá)部位是否發(fā)生改變及其作用機(jī)制，還有待于進(jìn)一步研究，從而有利于闡明這些疾病的發(fā)病機(jī)制和尋找到新的治療靶點(diǎn)。

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