甄偉 石大偉 趙玉玲 李輝 李亮 朱國峰

異煙肼（isoniazid，INH）是一種重要的抗結(jié)核藥物，其在細(xì)菌體內(nèi)被過氧化氫酶－過氧化物酶KatG氧化為乙酰異煙肼自由基和活性氧自由基等活性物質(zhì)，進(jìn)而攻擊結(jié)核分枝桿菌多個 靶 位 點(diǎn) 來 發(fā) 揮 殺 菌 作 用［1］。Zhang等［1］通 過Southern印跡雜交（Southern blot）發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌katG基因缺失和異煙肼耐藥相關(guān)。研究表明，異煙肼耐藥與許多基因相關(guān)，發(fā)生頻率最高的為katG編碼區(qū)和inhA啟動子區(qū)的突變［2－3］，katG315位突變最常見，有30%～94%的耐藥株發(fā)生該突變［2，4］，但國內(nèi)對于該基因其他位點(diǎn)的突變研究較少。本研究通過對河南省耐多藥（multidrug resistant，MDR）結(jié)核分枝桿菌katG編碼區(qū)全長突變進(jìn)行分析，進(jìn)一步分析異煙肼的耐藥機(jī)制。

材料和方法

一、菌株來源

115株MDR結(jié)核分枝桿菌臨床分離株（耐多藥菌株）和22株利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素全敏感結(jié)核分枝桿菌臨床分離株（藥物敏感菌株）均來自于2007—2009年間河南省疾病預(yù)防控制中心115例新發(fā)和復(fù)發(fā)結(jié)核病患者晨痰標(biāo)本。患者中男82例，女33例，年齡15～86歲?；颊吲R床診斷主要依據(jù)結(jié)核分枝桿菌檢測和胸部X線檢查等，確診所依據(jù)的診斷標(biāo)準(zhǔn)見參考文獻(xiàn)［5］。新發(fā)是指之前從未被發(fā)現(xiàn)或診斷為肺結(jié)核但痰涂片陽性。復(fù)發(fā)是指涂陽肺結(jié)核患者在得到有效化療后痰結(jié)核分枝桿菌轉(zhuǎn)陰，但隨病情已進(jìn)入好轉(zhuǎn)期或穩(wěn)定期后痰結(jié)核分枝桿菌重新復(fù)陽，同時出現(xiàn)活動性肺結(jié)核臨床表現(xiàn)或肺部X線病灶征象。藥敏實(shí)驗(yàn)中所用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株來自于北京結(jié)核病胸部腫瘤研究所。菌株分離培養(yǎng)、鑒定方法及藥敏實(shí)驗(yàn)的具體操作見參考文獻(xiàn)［5］，藥敏實(shí)驗(yàn)所用藥物均購自Sigma公司。

二、結(jié)核分枝桿菌基因組DNA的提取和耐藥相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增并測序

取菌株基因組DNA，具體操作按照參考文獻(xiàn)［6］進(jìn)行。采用Phusion DNA聚合酶（Finnzymes，F(xiàn)inland）擴(kuò)增katG基因。katG基因編碼區(qū)全長分兩段進(jìn)行擴(kuò)增和測序。PCR擴(kuò)增體系：采用50μl體系進(jìn)行PCR檢測，反應(yīng)體系為：基因組 DNA 模 板 3μl，緩 沖 液 （buffer）10μl，二 甲 基 亞 砜（DMSO）1．5μl，脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）2μl，引物各0．5μl，DNA聚合酶0．5μl，ddH2O 32μl。反應(yīng)循環(huán)條件為：預(yù)變性：98℃30s，98℃ 10s，65℃ 10s，72℃ 1min，35個循環(huán)；72℃延伸7min。測序引物序列見表1。有5株MDR菌株未得到可用于測序分析的PCR產(chǎn)物，因此可進(jìn)行katG突變分析的菌株總數(shù)為110株。由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成測序。

三、測序數(shù)據(jù)的分析

應(yīng)用軟件SeqMan Pro（version 7．1，DNAstar Lasergene Inc，USA）將測序數(shù)據(jù)與參比序列進(jìn)行比對分析。參比序列為結(jié)核分枝桿菌H37Rv的katG序列。比對后，若實(shí)驗(yàn)菌株的DNA序列與參比序列相同，則未發(fā)生突變；若不同，則為發(fā)生突變，并記錄突變位點(diǎn)的具體類型和頻率。

結(jié) 果

一、耐多藥菌株和藥物敏感菌株katG基因突變概況

1．耐多藥菌株katG突變概況：在110株MDR結(jié)核分枝桿菌中均檢測到katG基因突變（表2），突變位點(diǎn)有40個（以密碼子編號計算），其中同義突變?yōu)閗atG24和katG390。在結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因突變和多態(tài)性數(shù)據(jù)庫（www．tbdreamdb．com）中檢索上述40個突變位點(diǎn)，有19個突變位點(diǎn)未見記錄（包括同義突變katG24），有6個突變類型未見記錄（包括同義突變katG390）。

表1 katG基因PCR擴(kuò)增和測序相關(guān)信息

表2 異煙肼耐藥相關(guān)基因katG突變特征（按突變位點(diǎn)組合分析）

2．異煙肼敏感對照菌株katG突變概況：22株藥物敏感株中，僅在463位密碼子發(fā)現(xiàn)了突變，數(shù)目為20株，其他位點(diǎn)未檢測到突變。

二、異煙肼耐藥菌株katG基因突變類型和頻率

具體見表2。除去僅有同義突變或katG463突變的菌株9株，共101株MDR結(jié)核分枝桿菌發(fā)生katG基因突變，占91．8%（101／110），其中發(fā)生katG315突變的菌株最多，有68株，占61．8%（68／110），發(fā)生katG其他位點(diǎn)突變的菌株33株，占30．0%（33／110）。89．7%（61／68）的katG315突變?yōu)锳GC→ACC （Ser→Thr），其余為 AGC→AAC （Ser→Asn）。單獨(dú)發(fā)生katG315突變的有4株，katG315聯(lián)合katG463突變的有54株，其余10株均發(fā)生katG315、katG463和第三個位點(diǎn)的聯(lián)合突變；其次是katG428，有4株發(fā)生該突變，占3．6%（4／110），但這4株同時也發(fā)生katG315突變；發(fā)生其他單點(diǎn)突變菌株數(shù)目較少，為1或2株，但總數(shù)較大，共33株。

討 論

研究表明，50%以上異煙肼耐藥株發(fā)生katG315突變，突變頻率存在地區(qū)、研究群體的差異［7－10］。本研究中有61．8%（68／110）的菌株發(fā)生katG315突變，明顯低于俄羅斯（93．6%）［9］和巴西（87．1%）［11］，與中國東部（64．4%）［12］和北京（60．6%）［13］接近，高于中國香港（41．5%）［14］。MDR菌株對該突變的選擇壓力可能是造成此差異的原因之一，在中國東部5省的一項(xiàng)研究中，單耐異煙肼的結(jié)核分枝桿菌中有64．4%發(fā)生katG315突變［12］，低于同樣在中國東部開展但針對MDR結(jié)核分枝桿菌的研究所報道的突變頻率（72．7%，176／242）［15］。

本研究中katG基因各位點(diǎn)總突變率為91．8%（101／110），與現(xiàn)有報道無明顯差別［12］。katG315最主要突變類型是 AGC→ACC（89．7%，61／68），與多數(shù)研究一致［7－8，16］。本研究中，發(fā)生katG463突變菌株數(shù)目為103株，但對照菌株也發(fā)現(xiàn)該突變，這顯示該突變?yōu)槎鄳B(tài)性位點(diǎn)，多分布在亞洲、俄羅斯［17－18］，可 能 與 異 煙 肼 耐 藥 無 關(guān)［19－20］。 但 目 前 關(guān) 于 該位點(diǎn)和異煙肼耐藥關(guān)聯(lián)與否存在爭論。有研究表明具有katG463突變的結(jié)核分枝桿菌表現(xiàn)出和野生型相同的過氧化物－過氧化氫酶活性［21］，且該位點(diǎn)突變不能改變其酶活性［22］，但同時有研究發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與低 水平耐藥有關(guān)［12，22］。除去同義突變和多態(tài)性位點(diǎn)katG463，本研究中突變頻率katG428為3．6%（4／110），列第二位。目前為止，該突變未見其他文獻(xiàn)報道，且這4株菌同時也發(fā)生katG315突變，推測該位點(diǎn)對異煙肼耐藥可能不起主要作用。

目前認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥的分子機(jī)制涉及katG、inhA啟動子區(qū)、ahpC、oxyR等多個基因，為了達(dá)到較高的靈敏度，異煙肼耐藥性分子檢測也通?；诙鄠€基因及其突變的聯(lián)合檢測。研究顯示在檢測katG315突變的基礎(chǔ)上，聯(lián)合檢測inhA－15可以增加8．3%的異煙肼耐藥預(yù)測靈敏度，聯(lián)合檢測ahpC－10可以增加3．7%的靈敏度［15］。本研究通過對katG基因編碼區(qū)全長進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)katG基因315位點(diǎn)外的低頻單點(diǎn)突變廣泛存在于異煙肼耐藥結(jié)核分枝桿菌中，但在22株敏感對照菌株中并沒有發(fā)現(xiàn)這些突變，提示這些突變可能與異煙肼耐藥相關(guān)，但仍需要更大樣本的菌株群體檢測，來驗(yàn)證這些突變與異煙肼耐藥性的關(guān)系。本研究中發(fā)現(xiàn)除katG315之外的39個突變位點(diǎn)，其中7個位點(diǎn)與katG315聯(lián)合突變。Chan等［14］在中國香港的一項(xiàng)研究中也對katG基因全長進(jìn)行了測序分析，得到katG315外的31個低頻單點(diǎn)突變位點(diǎn)（其中有7個位點(diǎn)與katG315聯(lián)合突變），30個突變位點(diǎn)與異煙肼耐藥相關(guān)，有3個位點(diǎn)（katG155、katG127、katG289）在本研究中也發(fā)現(xiàn)相同突變。

綜上所述，katG315外的katG基因其他突變位點(diǎn)可能在異煙肼耐藥分子機(jī)制中存在作用，但仍需在更大樣本的菌株群體中和通過體外遺傳操作來驗(yàn)證。而對于異煙肼耐藥性的預(yù)測，通過檢測katG基因編碼區(qū)全長的突變可以獲得與檢測多個基因的突變相似的高靈敏度。

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