樂易林，邵蔚藍(lán)

江蘇大學(xué)環(huán)境學(xué)院 生物質(zhì)能源研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013

纖維素乙醇高溫發(fā)酵的研究進(jìn)展與展望

樂易林，邵蔚藍(lán)

江蘇大學(xué)環(huán)境學(xué)院 生物質(zhì)能源研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013

樂易林，邵蔚藍(lán). 纖維素乙醇高溫發(fā)酵的研究進(jìn)展與展望. 生物工程學(xué)報(bào), 2013, 29(3): 274?284.

Le YL, Shao WL. Advances in and challenges for thermophilic fermentation of cellulosic ethanol. Chin J Biotech, 2013,29(3): 274?284.

利用高溫細(xì)菌發(fā)酵，纖維素乙醇生產(chǎn)有望實(shí)現(xiàn)“生物質(zhì)降解-乙醇發(fā)酵-乙醇蒸餾”過程的同步化，從而最大限度地降低纖維素乙醇的生產(chǎn)成本；這是一個(gè)目標(biāo)更高、道路更遠(yuǎn)、科學(xué)性更強(qiáng)的可再生能源發(fā)展策略。纖維素乙醇高溫發(fā)酵研究已經(jīng)取得了重要進(jìn)展，目前面臨的主要挑戰(zhàn)包括發(fā)酵乙醇的高溫細(xì)菌的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)不夠穩(wěn)定、缺少內(nèi)源的高活性和耐熱性纖維素酶，以及乙醇代謝調(diào)控機(jī)理有待進(jìn)一步解析。這些科技難題將會(huì)在DNA生物合成和進(jìn)化技術(shù)、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，以及合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展中得到解決。

纖維素乙醇，高溫發(fā)酵細(xì)菌，代謝調(diào)控，遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，合成生物學(xué)

石油、煤炭等石化能源的生成需要經(jīng)歷上萬年的時(shí)間；近代工業(yè)的飛速發(fā)展使石化能源被迅速消耗、日漸枯竭，成為相對意義上的不可再生資源。20世紀(jì)70年代以來，世界經(jīng)歷了數(shù)次能源危機(jī)和經(jīng)濟(jì)危機(jī)，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到開發(fā)可再生的替代能源已經(jīng)成為人類社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略任務(wù)。地球上綠色植物的光合作用，每年產(chǎn)生大約1 500～2 000億t的碳水化合物，其中絕大部分是構(gòu)成植物支撐組織的木質(zhì)纖維；僅我國農(nóng)業(yè)，每年產(chǎn)生的秸稈就多達(dá)7億t。據(jù)估算，如果5%的木質(zhì)纖維中所含的生物質(zhì)能得到開發(fā)利用，人類對能源的需求就能夠得到滿足[1-2]。因此，木質(zhì)纖維原料的開發(fā)利用在現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域已經(jīng)形成了研究熱點(diǎn)。

木質(zhì)纖維原料水解產(chǎn)生的戊糖和己糖可以用作發(fā)酵原料生產(chǎn)各種發(fā)酵產(chǎn)品，如乙醇、乙酸、丙酮-丁醇、檸檬酸、氨基酸等。以木質(zhì)纖維為原料生產(chǎn)燃料乙醇是最早提出的可再生能源發(fā)展策略，也是投入最大、研究最多的科學(xué)技術(shù)。近年來，世界各國都在加強(qiáng)纖維素乙醇的研發(fā)，例如，美國國家資源保護(hù)委員會(huì)提出，在不減少食品和飼料生產(chǎn)的前提下，到 2050年全部運(yùn)輸燃料的50%將是燃料乙醇[1]。

1 纖維素乙醇的轉(zhuǎn)化途徑和策略

1.1 一般工藝流程及面臨的問題

從木質(zhì)纖維到燃料乙醇的轉(zhuǎn)化通常要經(jīng)過一個(gè)復(fù)雜的工藝流程，例如，最早提出并且研究得最多的稀酸水解工藝至少包含生物質(zhì)降解、乙醇發(fā)酵、乙醇蒸餾這3個(gè)過程 (圖1)。人們用目前通用的工藝生產(chǎn)纖維素乙醇[1]，所面臨的主要挑戰(zhàn)是生產(chǎn)成本居高不下，其中構(gòu)成生產(chǎn)成本的關(guān)鍵因素包括：

1) 秸稈等原料分散于農(nóng)田且比容很低，其收集與運(yùn)輸?shù)某杀鞠鄬芨摺?/p>

2) 木質(zhì)纖維經(jīng)過預(yù)處理，破壞了天然結(jié)構(gòu)以后才能被酶進(jìn)一步水解。預(yù)處理過程中需要消耗大量的化學(xué)品或熱能，并且增加了設(shè)備投資或污水處理成本。

3) 纖維素酶的生產(chǎn)成本高，應(yīng)用效率低。

4) 常用的乙醇發(fā)酵菌株缺少利用和轉(zhuǎn)化戊糖的能力或轉(zhuǎn)化效率很低。

5) 以木質(zhì)纖維水解液為原料，發(fā)酵液中的乙醇含量一般低于 5% (W/V)，這種低濃度乙醇的精餾能耗很高。

圖1 用酸處理木質(zhì)纖維生產(chǎn)纖維素乙醇的工藝流程Fig. 1 Procedures for the production of cellulosic ethanol via acid pre-treatment of lignocellulose.

國內(nèi)外科學(xué)家經(jīng)過種種努力，對通用工藝中的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行了卓有成效的優(yōu)化和改進(jìn)，取得了可喜的進(jìn)展。2012年8月11日的中國化工報(bào)上有報(bào)道稱：纖維素乙醇的生產(chǎn)成本已經(jīng)接近糧食乙醇[3]。然而，與一般工藝流程相比較，利用高溫菌進(jìn)行纖維素乙醇的發(fā)酵會(huì)形成一個(gè)不同的工藝；通過高溫發(fā)酵工藝有望實(shí)現(xiàn)“生物降解-發(fā)酵-蒸餾”同步化，從而最大限度地降低纖維素乙醇的生產(chǎn)成本。

1.2 高溫菌發(fā)酵可帶來的有利因素

嗜高溫微生物 (簡稱高溫菌) 是指最適生長溫度高于45 ℃的各種古菌、細(xì)菌、霉菌、酵母等微生物[4]。高溫菌的遺傳、代謝機(jī)理和常溫菌一樣，能夠通過發(fā)酵代謝生產(chǎn)多種目標(biāo)產(chǎn)品；所不同的是它們適應(yīng)高溫環(huán)境，所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有高度的活性和穩(wěn)定性。隨著科學(xué)研究技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的高溫菌得到分離培養(yǎng)，為人們選擇利用其細(xì)胞功能和酶功能提供了豐富的資源。美國Wiegel和Ljungdahl教授于1986年發(fā)表了一篇題為“嗜高溫細(xì)菌在生物技術(shù)中的重要性”的經(jīng)典性論文，并在這篇論文中總結(jié)了高溫菌用于生物工程可能帶來的有益效果[4]。這些潛在的有益效果包括：

1) 高溫下代謝活性較高，可加速產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。

2) 高溫條件可殺滅雜菌或抑制雜菌的生長，減少發(fā)酵污染。

3) 減少滅菌后對降溫的需求；無需通過降溫 (＜20 ) ℃終止生物反應(yīng)。

4) 高溫提高化合物的分散度、離子化和溶解度。

5) 高溫菌能耐受或利用生物降解代謝和攪拌產(chǎn)生的熱量。

6) 發(fā)酵液的密度、表面張力和粘度有所降低。

7) 揮發(fā)性的目標(biāo)產(chǎn)物能夠在發(fā)酵過程中得到收集和提取。

8) 高溫菌產(chǎn)生熱穩(wěn)定性酶和蛋白質(zhì)。

9) 高溫菌產(chǎn)生較少細(xì)胞殘?bào)w，提高產(chǎn)物與底物之比例。

1.3 高溫菌用于纖維素乙醇生產(chǎn)的潛力分析

正如Taylor等指出，許多高溫菌具有很強(qiáng)的降解纖維素、半纖維素的能力并且能夠非常有效地發(fā)酵戊糖[5]。即使是常溫菌所產(chǎn)生的酶，其最適反應(yīng)溫度也通常在45 ℃以上，因此，高溫發(fā)酵為充分發(fā)揮酶的催化活性提供了有利條件。纖維素乙醇是典型的揮發(fā)性目標(biāo)產(chǎn)物，在50 ℃以上的發(fā)酵時(shí)略加減壓，乙醇就能夠被蒸發(fā)回收[4-5]。綜合而言，高溫菌發(fā)酵生產(chǎn)纖維素乙醇的優(yōu)勢發(fā)揮到極致時(shí)，人們能夠?qū)⒊Ｒ?guī)的三大步驟合為一步，即：同步進(jìn)行原料的生物降解、乙醇發(fā)酵和產(chǎn)物分離。不難看出，如果利用高溫菌實(shí)現(xiàn)生物降解、發(fā)酵、蒸餾的同步化，纖維素乙醇的生產(chǎn)能夠通過以下方法削減投入或降低消耗。

1) 高溫菌自身產(chǎn)酶，不需要產(chǎn)酶設(shè)施，不需要纖維素酶發(fā)酵原料和能耗。

2) 乙醇能在發(fā)酵過程中被蒸餾，可減少對蒸餾裝置的需求和降低蒸餾能耗。

3) 工序簡化后減輕裝備，能夠多處設(shè)置作坊，降低原料運(yùn)輸成本。

4) 高溫菌轉(zhuǎn)化戊糖的能力與轉(zhuǎn)化葡萄糖的能力相當(dāng)，不需要代謝工程改造。

5) 原料預(yù)處理中，低溫氨爆處理法的耗能和投資需求較低，較少產(chǎn)生抑制物質(zhì)[1]，但是處理后半纖維素較完整，需要用酶水解。高溫菌能夠產(chǎn)生所需要的半纖維素酶。

自20世紀(jì)80年代初，美國科學(xué)家就提出用高溫菌發(fā)酵乙醇的策略，并且開始嘗試將高溫細(xì)菌運(yùn)用于燃料乙醇的工業(yè)發(fā)酵過程[6-7]。此后，很多歐美科學(xué)家圍繞乙醇高溫發(fā)酵相關(guān)的課題展開全方位的研究。最近幾年，由于解糖嗜熱厭氧芽胞桿菌Thermoanaerobacterium saccharolyticum、馬瑞氏嗜熱厭氧桿菌Thermoanaerobacter mathranii、嗜熱葡糖苷酶芽胞桿菌Geobacillus thermoglucosidasius等高溫菌株的代謝途徑工程取得了研究進(jìn)展，在美國誕生了數(shù)家以纖維素乙醇高溫發(fā)酵為主體技術(shù)的生物公司[5]。

2 纖維素乙醇高溫發(fā)酵的研究進(jìn)展

2.1 乙醇高溫發(fā)酵菌株

有些高溫菌能夠利用半纖維素和淀粉生長、高效轉(zhuǎn)化木糖，并且以乙醇為主要發(fā)酵產(chǎn)物，它們被推薦為乙醇發(fā)酵工程菌 (表 1)；為了實(shí)現(xiàn)纖維素的水解和轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生高活性纖維素酶的菌株糞堆梭狀芽胞桿菌Clostridiumstercocarium或熱纖梭狀芽胞桿菌C. thermocellum被組合到乙醇發(fā)酵過程中，進(jìn)行纖維素乙醇的共發(fā)酵[3]。隨著代謝工程技術(shù)的發(fā)展，美國科學(xué)家對能夠利用半纖維素快速生長但是產(chǎn)生混合酸的菌株如T. saccharolyticum、T. mathranii、G. thermoglucosidasius等進(jìn)行了乳酸、乙酸途徑的阻斷，獲得了以乙醇為主要發(fā)酵產(chǎn)物的基因工程菌[4,8]。

高溫菌中有很多菌株能夠降解利用木聚糖類半纖維素；絕大多數(shù)菌株具有混合酸發(fā)酵途徑，其中的乙醇發(fā)酵途徑較弱。人們根據(jù)所要達(dá)到的目標(biāo)來選擇起始研究菌株。如果最終目標(biāo)是構(gòu)建一個(gè)能夠同步完成“生物降解-發(fā)酵-蒸餾”過程的菌株，首先需要考慮如何充分利用菌株固有的優(yōu)勢，如降解纖維素和半纖維素的能力、產(chǎn)物以乙醇為主、高于乙醇沸點(diǎn)的生長溫度等等。同樣重要的是要善于發(fā)現(xiàn)和運(yùn)用最前沿的科學(xué)技術(shù)和前人的工作基礎(chǔ)，例如，Wiegel研究組分離和鑒定了T. saccharolyticumJW/SL-YS485；Shao等研究了該菌株的半纖維素酶系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)多種新型高效酶[10-13]；Mai等構(gòu)建了該菌株的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[14]；最后，Lynd研究組將該菌株成功地構(gòu)建成基因工程菌株，其利用混合糖發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量高于經(jīng)過代謝工程的釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌Zymomonas mobilis菌株[8]。進(jìn)入21世紀(jì)以來，對于纖維素乙醇高溫發(fā)酵菌株的研究再次掀起熱潮，并且在分子水平上形成了幾個(gè)重要的研究焦點(diǎn)：嗜熱厭氧乙醇桿菌Thermoanaerobacter ethanolicus的基因組學(xué)和乙醇代謝調(diào)控機(jī)理研究，C. thermocellum和T. saccharolyticum的纖維素酶和半纖維素酶研究，以及T. mathranii、T. saccharolyticum和G. thermoglucosidasius的代謝工程研究。

表1 有效轉(zhuǎn)化木糖發(fā)酵乙醇的重要高溫菌Table 1 Important thermophiles able to convert xylose to ethanol

2.2 半纖維素水解能力

半纖維素是木質(zhì)纖維中可利用的主要碳水化合物之一，可以被酸水解；經(jīng)過其他方法預(yù)處理的木質(zhì)纖維中，半纖維素成分需要在一系列的半纖維素水解酶的作用下才能產(chǎn)生可利用的單糖。僅木聚糖類半纖維素水解酶就需要內(nèi)切木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、a-葡萄糖醛酸酶等多種酶的共同作用，才能得到充分水解和利用，因此，發(fā)酵工程菌自身具備利用木聚糖的能力是降低產(chǎn)品成本的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

T. ethanolicusJW200是最早發(fā)現(xiàn)的以乙醇為主要發(fā)酵產(chǎn)物的極端嗜熱細(xì)菌[9,15]。T. ethanolicusJW200能夠以木聚糖為唯一碳源生長，但是生長速度較慢；Shao等研究了其中的木聚糖水解酶的活性，發(fā)現(xiàn)該菌株雖然能夠產(chǎn)生一種木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶活性很高的雙功能酶[16]，但是它產(chǎn)生的木聚糖內(nèi)切酶的活性較低。為了加強(qiáng)T. ethanolicusJW200利用木聚糖的能力，Wiegel研究組開始分離新菌株，尋找新型熱穩(wěn)定性木聚糖酶酶系統(tǒng)以及相應(yīng)的外源基因。隨后，該研究組獲得了菌株T. saccharolyticumJW/SL-YS485及其獨(dú)特的木聚糖水解酶系。

T. saccharolyticumJW/SL-YS485的最高及最適生長溫度比T. ethanolicus低大約9 ℃；發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、乙酸和少量乙醇；但是它比T. ethanolicus易于培養(yǎng)，其木聚糖水解酶活性高、系統(tǒng)完整、熱穩(wěn)定性較好。該菌株產(chǎn)生一種結(jié)合在細(xì)胞表面的木聚糖酶，能夠有效地防止酶的流失；還產(chǎn)生2種乙酰酯酶和1種a-葡萄糖醛酸酶，有效分解源自雙子葉植物的木聚糖的側(cè)枝[10-12]。更有趣的是該菌株同時(shí)產(chǎn)生3種性質(zhì)不同的木糖苷酶，其中 1種木糖苷酶能夠耐受高濃度木糖的反饋抑制，它的酶學(xué)性狀不同于所有已知的糖苷水解酶家族的特征，因此建立了 1個(gè)獨(dú)立的新家族—— GH120[13]。這些性狀表明，T. saccharolyticumJW/SL-YS485不僅能夠?yàn)榛蚬こ叹甑臉?gòu)建提供優(yōu)選的外源基因，它自身也是構(gòu)建代謝工程菌的優(yōu)選菌株。

2.3 乙醇高溫發(fā)酵條件與乙醇產(chǎn)量問題

20世紀(jì)80年代初，美國科學(xué)家對能夠利用半纖維素產(chǎn)生乙醇的高溫菌天然菌株及其突變體進(jìn)行了大量的乙醇發(fā)酵試驗(yàn)；他們積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)也觀察到一些當(dāng)年不能解釋的現(xiàn)象。早年所用的發(fā)酵菌株主要包括嗜熱產(chǎn)硫化氫梭狀芽胞桿菌Clostridium thermohydrosulfuricum39E(現(xiàn)用名：T. ethanolicus39E[17])，T. ethanolicusJW200及其衍生菌株、布洛克嗜熱厭氧非芽胞菌Thermoanaerobium brockii等；用C. thermocellum與上述菌株進(jìn)行共發(fā)酵時(shí)，可以直接利用纖維素為碳源產(chǎn)生乙醇[3]。試驗(yàn)結(jié)果表明，T. ethanolicus轉(zhuǎn)化木糖產(chǎn)生乙醇的產(chǎn)物/底物比值達(dá)到1.5 (mol/mol)；混合底物發(fā)酵的優(yōu)選配方為20%淀粉、10%葡萄糖、6%木糖或木聚糖，發(fā)酵乙醇的產(chǎn)量接近4%。

高溫菌利用戊糖和己糖的混合底物發(fā)酵時(shí)，乙醇產(chǎn)量與基因改造后的S. cerevisiae或Z. mobilis相似，但是用高濃度葡萄糖發(fā)酵時(shí)乙醇最終發(fā)酵濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于S. cerevisiae[3-4]。Ben-Bassat等1981年研究發(fā)現(xiàn)，T. brockii的生長受到乙醇的抑制，因此形成的觀念是：高溫菌對乙醇的耐受力低，從而導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量低[4,18]。Burdete等通過對T. ethanolicus39E進(jìn)行化學(xué)誘變獲得一個(gè)能夠在8%乙醇的培養(yǎng)基中生長的突變株，最近也有一些關(guān)于分離耐受高濃度乙醇的新型高溫菌的報(bào)道和溶劑耐受機(jī)理的研究[4,19-20]。有趣的是T. ethanolicus39E的突變株對生長環(huán)境中的乙醇的耐受性雖然有了大幅度提高，其發(fā)酵產(chǎn)生內(nèi)源乙醇的能力卻沒有增加；其他新分離的乙醇耐受性菌株在乙醇發(fā)酵能力方面也未見新的突破。

迄今為止，高溫菌和常溫菌之間在代謝途徑、代謝生理方面沒有發(fā)生本質(zhì)上的差異。然而，特別的例子是Z. mobilis和S. cerevisiae的發(fā)酵乙醇的方式：它們通過丙酮酸脫羧酶產(chǎn)生乙醛，再由醇脫氫酶將乙醛轉(zhuǎn)化為乙醇；而在其他常溫或高溫細(xì)菌中，丙酮酸脫羧酶尚未見報(bào)道。一般常溫菌和高溫菌的發(fā)酵途徑大多為混合酸發(fā)酵途徑，雖然有些高溫細(xì)菌如T. ethanolicus等的主要發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇，它們?nèi)匀粫?huì)產(chǎn)生少量乳酸、乙酸等；即使這些有機(jī)酸消耗底物不多，但可能足以改變生存環(huán)境或誘導(dǎo)細(xì)胞休眠和凋亡。高溫菌代謝途徑工程在近幾年取得了較大的突破：T. mathranii、T. saccharolyticum、G. thermoglucosidasius分別經(jīng)過基因敲除阻斷了乳酸、乙酸發(fā)酵途徑，其纖維素乙醇發(fā)酵水平已經(jīng)趕上或超過了目前最好的S. cerevisiae代謝工程菌株[4,8]。這些實(shí)例充分證明高溫菌和Z. mobilis以外的常溫細(xì)菌一樣，乙醇發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)不到工業(yè)化要求的重要原因之一是它們具有混合酸發(fā)酵途徑。

2.4 代謝途徑與調(diào)控機(jī)制研究

2.4.1 同功酶的發(fā)現(xiàn)與生理功能的解析

除Z. mobilis以外，細(xì)菌厭氧發(fā)酵中的乙醇發(fā)酵途徑通常是由醛脫氫酶和醇脫氫酶催化的從乙酰輔酶 A (Ac-CoA) 經(jīng)乙醛產(chǎn)生乙醇的代謝支路 (圖2A)。20世紀(jì) 80年代末，人們開始研究T. ethanolicus體系中的醛脫氫酶和醇脫氫酶，至2000年，先后純化了2種醇脫氫酶 (酶A和酶B)，并克隆了相應(yīng)的基因adhA和adhB[21-23]。由于在常規(guī)條件下醛脫氫酶活性很脆弱，而酶B又顯示兼有醛脫氫酶活性，美國科學(xué)家Zeikus等認(rèn)為酶 B是催化產(chǎn)生乙醇的關(guān)鍵酶 (圖 2B)[22]。Peng等 2008年報(bào)道了醛脫氫酶 (酶 E) 及其基因adhE，并發(fā)現(xiàn)它僅出現(xiàn)于以乙醇為主要產(chǎn)物的菌株中；Pei等發(fā)現(xiàn)adhE具有醛/醇脫氫酶雙功能，從而揭示乙醇轉(zhuǎn)化途徑中包含2個(gè)醛/醇雙功能脫氫酶和1個(gè)醇脫氫酶，大多數(shù)催化反應(yīng)都可能有2～3種同功酶的參與 (圖2C)[24-25]。

圖2 嗜熱厭氧桿菌的乙醇發(fā)酵途徑及關(guān)鍵酶[25]Fig. 2 Schemes for the ethanol pathway in Thermoanaerobacter spp. (A) Reactions in the final steps of the ethanol pathway in anaerobes. (B) The scheme proposed before adhE was identified. (C) The new scheme based on observed enzyme activities [25].

要在一個(gè)多酶體系中進(jìn)行代謝工程，首先必須了解各個(gè)酶的生理功能和重要性。在生理?xiàng)l件下分析酶的生理功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，純化的酶B和酶E雖然在酶學(xué)條件下都具有醛/醇脫氫酶雙重活性，但是在模擬的生理?xiàng)l件下，酶B只有微弱的醛脫氫酶活性，其主要功能是催化乙醛與乙醇之間的可逆反應(yīng)；酶E具有很高的醛脫氫酶活性而沒有醇脫氫酶活性[25]。細(xì)胞提取液中脫氫酶活性的分析表明，酶E是保證乙醛快速生成或消耗的關(guān)鍵酶，在細(xì)胞中的比活性比來自酶A和B的醇脫氫酶總活性高10倍左右；酶B的功能與美國學(xué)者的推斷不同，它在乙醇濃度較高時(shí)主要催化消耗乙醇的逆反應(yīng)。但是，酶B在發(fā)酵早期具有微弱的醛脫氫酶活性，可啟動(dòng)乙醇的少量生成[25]，這可能是將代謝流導(dǎo)向乙醇發(fā)酵途徑、減少乙酸或乳酸發(fā)酵的必要條件。

2.4.2 脫氫酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控現(xiàn)象及調(diào)控因子的研究

通過實(shí)時(shí)定量PCR測定3種脫氫酶基因的轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果表明adhB的轉(zhuǎn)錄不需要乙醇的誘導(dǎo)，而adhA和adhE需要少量乙醇的誘導(dǎo)才能進(jìn)行表達(dá)；但是，adhB和adhE的轉(zhuǎn)錄水平隨著乙醇濃度的進(jìn)一步提高而逐步下降。葡萄糖對基因轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有直接影響，但是稍后所產(chǎn)生的內(nèi)源乙醇引起同樣的效應(yīng) (圖3)[25]。

通過以adhB和adhE上游的轉(zhuǎn)錄及調(diào)控區(qū)域的DNA制備特異性的親和層析載體發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞提取液中有3種蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生特異性的結(jié)合[26]。Pei等從中發(fā)現(xiàn) 1種還原力感應(yīng)蛋白(RSPTet)，與已研究報(bào)道的同類蛋白的同源性不到41%；它在凝膠阻滯試驗(yàn)中能夠分別與adhB和adhE上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的DNA結(jié)合；濃度低至1 μmol/L的NADH就能夠解除RSPTet與DNA的結(jié)合。體外轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)證明，adhB和adhE的轉(zhuǎn)錄能夠被RSPTet完全阻遏，但是 NADH的出現(xiàn)導(dǎo)致解阻遏，NAD+又能夠干擾 NADH的解阻遏作用[26]。此前報(bào)道過的還原力感應(yīng)蛋白都源自好氧微生物，它們的調(diào)控節(jié)點(diǎn)是將還原力導(dǎo)入電子傳遞鏈的 NADH脫氫酶；而 RSPTet不參與NADH脫氫酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，它是糖酵解途徑與發(fā)酵途徑之間的調(diào)控樞紐。微生物在厭氧發(fā)酵中只能從糖酵解途徑獲得生存所需的ATP，這個(gè)過程中產(chǎn)生的大量還原力需要通過發(fā)酵途徑傾瀉，RSPTet能夠控制發(fā)酵途徑的強(qiáng)弱以保持還原力的平衡。

圖 3 通過實(shí)時(shí)定量 PCR測定乙醇對靜息細(xì)胞中adhA，adhB和adhE基因轉(zhuǎn)錄水平的影響[25]Fig. 3 Relative abundance of mRNA transcribed from adhA, adhB, and adhE. The cells were incubated under anaerobic conditions at 69 ℃ for 0.5 h in the presence of 0%, 0.25%, 0.75%, and 1% ethanol [25].

2.4.3 調(diào)控基因和調(diào)控機(jī)理的解析

Pei等在adhA、adhB、adhE上游的基因轉(zhuǎn)錄-翻譯元件區(qū)域共發(fā)現(xiàn) 4個(gè) RSPTet結(jié)合位點(diǎn)，典型操縱基因具有完全互補(bǔ)的回文序列-ATTGTTANNNNNNTAACAAT-，它的 20個(gè)堿基正好涵蓋DNA雙螺旋的兩周，形成立體結(jié)構(gòu)上完全對稱的反向重復(fù)[26]。試驗(yàn)證明，序列不完全互補(bǔ)的操縱基因的出現(xiàn)是因?yàn)榛匚膬啥说闹貜?fù)序列中的有些堿基可以被特定的堿基所取代，然而這些堿基的取代產(chǎn)生的異型操縱基因與RSPTet的親和力明顯低于典型操縱基因。操縱基因的分析表明，操縱基因在各個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控區(qū)的分布是實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)性調(diào)控的基礎(chǔ)，而不同操縱基因之間序列的差異是實(shí)現(xiàn)精密調(diào)控的必要條件。adhB的上游有1個(gè)異型操縱基因，與RSPTet的親和力較低，低濃度的NADH就能夠解阻遏；而adhA和adhE的上游都有1個(gè)典型操縱基因，adhE的上游還存在著另一個(gè)異型操縱基因，NADH積累較多時(shí)它們才被誘導(dǎo)表達(dá)。

3 面臨的挑戰(zhàn)

3.1 乙醇發(fā)酵途徑需要優(yōu)化改造

關(guān)鍵酶的催化功能和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究表明：嗜熱厭氧菌屬的乙醇產(chǎn)生菌株中存在一種對乙醇代謝途徑進(jìn)行系統(tǒng)性精確調(diào)控的機(jī)制，而乙醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶能夠?qū)崟r(shí)調(diào)整乙醇的生成與消耗反應(yīng)。在分批發(fā)酵中，乙醇的生成和消耗可能經(jīng)歷這樣一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過程：1) 酶 B在發(fā)酵初期表達(dá)，此酶在pH≥7.2時(shí)活性高，及時(shí)催化Ac-CoA將代謝引入乙醇發(fā)酵途徑；2) 隨著乙醇的增加和NADH積累，脫氫酶A和E得到誘導(dǎo)表達(dá)；3) 酶E快速催化Ac-CoA到乙醛的轉(zhuǎn)化，酶A和B共同催化從乙醛到乙醇的之間的可逆反應(yīng)，此時(shí)以乙醇的生成為主要反應(yīng)；4) 隨著乙醇濃度的提高，酶B和E基因的轉(zhuǎn)錄減緩，乙醇消耗反應(yīng)加強(qiáng)，使乙醇的最終濃度停留在特定的水平上。

解析代謝途徑及其調(diào)控機(jī)理的目的不僅僅是為了認(rèn)識(shí)相關(guān)的自然規(guī)律或基礎(chǔ)科學(xué)問題，更重要的目的是了解如何打破代謝途徑的自然調(diào)控，如何設(shè)計(jì)和改造自然系統(tǒng)，建立更為有效的新體系。例如，Peng等用帶有adhE的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化T. ethanolicus，證明增加adhE拷貝數(shù)能夠提高乙醇產(chǎn)量[24,27]。但是截至目前，代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中還有一些問題沒有得到明確的解釋，例如：在耐乙醇的突變菌株中，酶 A的活性明顯下降[19]，而酶 A的生物活性極不穩(wěn)定，其生理功能難以解析；從圖3中可以看出，靜息細(xì)胞中酶B和酶E的基因轉(zhuǎn)錄明顯受到乙醇的抑制，這種反饋抑制的機(jī)理還不明了。進(jìn)一步闡明這些問題是正確設(shè)計(jì)代謝工程或合成生物學(xué)技術(shù)方案的必要條件。

3.2 熱穩(wěn)定性的高活性纖維素酶和半纖維素酶

木質(zhì)纖維的降解利用過程中，結(jié)晶態(tài)纖維素的水解是主要瓶頸。纖維素酶的研究在國內(nèi)外已經(jīng)有大量的成果積累，研究得最多的是木霉產(chǎn)生的纖維素酶系和熱纖梭菌C. thermocellum的纖維素酶小體。這些酶的活性比其他來源的纖維素酶的活性相對較高，但是它們的催化速度、穩(wěn)定性還達(dá)不到工業(yè)化應(yīng)用的要求，從而使酶的應(yīng)用成本偏高。將外源基因克隆到發(fā)酵乙醇的高溫菌中適時(shí)表達(dá)和分解纖維素底物，可以節(jié)省纖維素酶生產(chǎn)的費(fèi)用；但是這些基因所編碼的酶在高溫生長條件下必須具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

許多高溫菌具有很好的半纖維素酶活性。但是，這些酶通常都是誘導(dǎo)酶，在單糖濃度較高的條件下，基因轉(zhuǎn)錄和酶的活性通常會(huì)受到抑制[13,16]。與此相反，高糖發(fā)酵液是實(shí)現(xiàn)高濃度乙醇發(fā)酵的必要條件。因此，人們一方面要采用各種耐受高糖的高活性酶，另一方面要打破這些酶的自然表達(dá)調(diào)控機(jī)制，使這些酶的基因成為持家基因；同時(shí)，還希望這些酶的催化活性比較持久，或者說有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。所有這些目標(biāo)都期待著通過基因重組來實(shí)現(xiàn)。

3.3 高溫細(xì)菌缺少穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)

對高溫菌實(shí)施基因重組和代謝途徑工程已經(jīng)成為迫切需要。美國 Wiegel研究組首先構(gòu)建了適用于高溫厭氧芽胞桿菌Thermoanaerobacterium的穿梭質(zhì)粒和整合質(zhì)粒pIKM1[14,28]；Peng等對高溫厭氧桿菌Thermoanaerobacter發(fā)展了的基因轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pTE16和相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)[27]；為了提高轉(zhuǎn)化率，Lin等將超聲波轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)用于嗜熱厭氧細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)化，提高了質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的效率[29]。這些遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展為當(dāng)前高溫菌的分子生物學(xué)研究和基因敲除試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)[8,24]。但是，這些遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是在E. coli-Clostridium acettobutylicum的穿梭質(zhì)粒pIMP1的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，它們在高溫細(xì)菌宿主細(xì)胞中很不穩(wěn)定，甚至不能篩選到轉(zhuǎn)化子的單菌落；只能靠轉(zhuǎn)化后的一次混合培養(yǎng)來分析目標(biāo)基因所表現(xiàn)的性狀。迄今為止，還沒有產(chǎn)生穩(wěn)定性更好的適合于高溫細(xì)菌基因轉(zhuǎn)化的新型質(zhì)粒。因此，遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的缺乏是對高溫乙醇發(fā)酵菌株實(shí)施大規(guī)模基因修飾和改造所面臨的技術(shù)瓶頸。

4 展望

通過分子改造或生物合成將高溫菌的優(yōu)異性狀組合到發(fā)酵工程菌株中，能夠?qū)崿F(xiàn)纖維素乙醇工藝中的“生物降解-發(fā)酵-蒸餾”的同步化，從而盡可能降低纖維素乙醇的生產(chǎn)成本。同步進(jìn)行“生物降解-發(fā)酵-蒸餾”是纖維素乙醇發(fā)展中的一個(gè)目標(biāo)更高、道路更遠(yuǎn)、科學(xué)性更強(qiáng)的可再生能源發(fā)展策略。歐美科學(xué)家在 30多年前就開始研究以高溫細(xì)菌進(jìn)行乙醇發(fā)酵和高溫細(xì)菌水解利用纖維素、半纖維素的能力和機(jī)理，所取得的科學(xué)進(jìn)展為今后的研究和發(fā)展奠定了良好的基礎(chǔ)。目前面臨的主要挑戰(zhàn)包括發(fā)酵乙醇的高溫細(xì)菌的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的不夠穩(wěn)定、缺少內(nèi)源的高活性和耐熱性的纖維素酶，以及代謝途徑及其調(diào)控機(jī)理有待于進(jìn)一步解析。這些科技難題將會(huì)在DNA生物合成和進(jìn)化技術(shù)、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，以及合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展中得到解決。同時(shí)，雖然有些國際公司已經(jīng)在嘗試用高溫菌生產(chǎn)纖維素乙醇，其技術(shù)前沿與人們的最高目標(biāo)之間還有相當(dāng)?shù)木嚯x；我們在該領(lǐng)域有很大的發(fā)展空間和機(jī)遇。但是我們應(yīng)當(dāng)注意到，歐美國家的學(xué)者對本領(lǐng)域科技前沿信息的接受與拓展速度是非常驚人的，例如，關(guān)于乙醇代謝途徑調(diào)控機(jī)理的論文發(fā)表以后，很快就被引用到不同菌株或不同產(chǎn)物的研究中，新的研究結(jié)果已見報(bào)道[30-36]。我們需要更多有志解決科學(xué)問題、有發(fā)明創(chuàng)造能力的科技工作者的參與。

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January 11, 2013; Accepted: February 6, 2013

Weilan Shao. Tel: +86-511-88796122; E-mail: weilanshao@gmail.com

國家自然科學(xué)基金 (No. 31170027)，江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程 (PAPD) 項(xiàng)目資助。

Advances in and challenges for thermophilic fermentation of cellulosic ethanol

Yilin Le, and Weilan Shao

Biofuels Institute,School of Environment,Jiangsu University,Zhenjiang212013,Jiangsu,China

Thermophiles can produce cellulosic ethanol at a high temperature where ethanol is directly distillated from fermentation, and biodegradation of lignocellulose can be simultaneously achieved when these thermophiles carry and express cellulase and hemicellulase genes. The simultaneous biodegradation, fermentation and distillation, a three-in-one process, can result in low production costs of cellulosic ethanol. We reviewed the advances and challenges in the approach to the three-in-one process, which refer to lignocellulases, regulation mechanisms, and genetic transfer systems.

cellulosic ethanol, thermophiles, regulation mechanisms, genetic transfer systems, synthetic biology

Supported by: Nantional Natural Science Foundation of China (No. 31170027), PAPD of Jiangsu Higher Education Institutions.

(本文責(zé)編 陳宏宇)