張曉軍，李春英，劉帥華，劉德曼，李 朝，施昆明，趙春建*

（1.吉林省林業(yè)科學研究院，長春130033;2.東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040）

山竹（Garcinia mangostanaL.）又稱山竹子、鳳果、莽吉柿，是藤黃科（Guttiferae）藤黃屬（Garcinia）常綠喬山竹的果實，原產(chǎn)于馬來西亞和印度尼西亞，是一種典型的熱帶水果，主要分布于泰國、越南、馬來西亞、印度尼西亞和菲律賓等東南亞國家，我國臺灣、福建、云南和廣東也有引種［1］。山竹果皮一直作為泰國傳統(tǒng)醫(yī)藥用于腹痛、腹瀉、痢疾、感染性創(chuàng)傷、慢性潰瘍、白帶、淋病、乳腺癌、白血病、肝癌等疾病治療［2－6］。近年來，山竹特別是山竹果皮的化學成分及其生物學活性成為人們的研究熱點［7－9］。本文旨在探討山竹抗氧化活性物質(zhì)的提取工藝，為山竹果皮的開發(fā)利用提供基礎數(shù)據(jù)。

近年來，超聲技術在天然產(chǎn)物提取中已顯示出巨大的優(yōu)勢［10－12］，利用超聲波產(chǎn)生的振動、空化效應、攪拌作用等可以加速植物有效成分進入溶劑，提高提取率，縮短提取時間，簡化提取操作步驟。本文以山竹果皮為原料，采用超聲法對其中抗氧化活性物質(zhì)提取的方法進行研究，獲得優(yōu)化的超聲提取條件，為山竹果皮的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山竹購自哈爾濱市水果市場，去除果肉，果皮氣干后，用小型粉碎機粉碎后進行提取。

1，1－二苯基－2－苦基肼（DPPH）、兒茶素、β－胡蘿卜素（Sigma公司）;乙醇、氯仿、亞油酸、吐溫、三羥甲基氨基甲烷，鹽酸，鎢酸鈉，鉬酸鈉，磷酸，液溴 （以上試劑均為分析純）;實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 主要儀器與設備

KQ5200DB型超聲波清洗儀，昆山市超聲波儀器有限責任公司;5418型離心機，Eppendorf公司;UV－2550型紫外－可見分光光度計，島津公司，日本;PHSJ－5型pH計，上海精密科學儀器有限公司;HYQ－2121A型渦旋混勻器，南京暢翔儀器設備有限責任公司;R－1001－V/VN旋轉蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.3 樣品溶液的制備

山竹果皮60℃烘干、用小型粉碎機粉碎、過60目篩。精確稱取山竹果皮粉若干份，每份1.5 g，分別加一定量的提取溶劑進行提取，提取液過濾、定容至50 mL，濾液離心取上清、待測。

1.4 DPPH法檢測抗氧化性

參考Gyamfi等的方法［13］，并做適當調(diào)整。取1 000 μL DPPH 乙醇溶液（0.1 mm）、450 μL Tris－HCl緩沖液（50 mm，pH 7.4）與 100 μL樣品或兒茶素溶液，渦旋混勻后避光靜置30 min，于517 nm下測定吸光值。以100 μL與樣品溶液濃度相同的乙醇代替樣品同法操作，為對照。本試驗3次重復。根據(jù)吸光值計算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率式中:Aa為試驗組吸光值;AC為對照組吸光值。

1.5 β－胡蘿卜素漂白法檢測抗氧化性

參照陳炳華等［14］的方法進行檢測。

1.6 總酚含量測定

總酚含量按照Kujala等的Folin－Ciocalteu法測定［15］，并適當修改，以兒茶素為對照品進行檢測。試驗時，取500 μL Folin－Ciocalteu試劑（1 N）加入500 μL不同濃度兒茶素于離心管中，渦旋混勻30s，并靜置5 min后，添加1 mL 20%Na2CO3再靜置10 min，離心，取上清液，于730 nm測定吸光值，并根據(jù)此吸光值與兒茶素濃度繪制標準曲線。樣品分析時，以500 μL樣品取代兒茶素，其余操作同上。將樣品吸光值代入上述標準曲線，計算出每毫升提取液中所含兒茶素相對量，并以此表示總酚含量，本試驗3次重復。

1.7 山竹果皮抗氧化活性成分超聲提取工藝的正交試驗設計

在預試驗的基礎上，分別以乙醇濃度 （A）、超聲時間 （B）、超聲溫度 （C）和液料比 （D）為影響因素，以100μL提取液的DPPH自由基清除率為指標，進行L16（45）正交試驗。

2 結果與分析

2.1 提取條件對山竹果皮提取液DPPH自由基清除率的影響

對正交試驗的結果進行方差分析和顯著性檢驗，正交試驗結果、方差分析結果分別見表1和表2。

表1 L16（45）正交試驗結果Tab.1 Results of L16（45）orthogonal experiment

表2 DPPH自由基清除率的方差分析Tab.2 Variance analysis of scavenging rate on DPPH free-radical

2.2 正交試驗結果分析

由表1的極差和表2的方差分析結果可以看出，4種因素對超聲提取結果影響大小依次為:乙醇濃度A＞超聲時間B＞超聲溫度C＞液料比D。以影響最大的2個因素乙醇濃度和超聲時間對提取液DPPH自由基清除率作圖，結果如圖1所示。

圖1 乙醇濃度和提取時間對提取液清除DPPH能力影響Fig.1 The effect of ethanol concentration and extraction time on scavenging DPPH of the extracts

根據(jù)極差分析結果，確定在試驗設計的范圍內(nèi)，最優(yōu)的試驗方案為 A2B3C3D1，即乙醇濃度60%、超聲時間30 min、超聲溫度40℃和液料比10 mL/g。

2.3 抗氧化活性成分超聲提取的數(shù)學模擬

對超聲提取的試驗結果進行逐步回歸分析，并剔除最小的影響因素液料比，得到回歸方程:

式中:X1為乙醇濃度;X2為超聲時間，min;X3為超聲溫度，℃;Y為DPPH自由基清除率，%。

方程回歸系數(shù)R=0.9652，可以看出模擬值與試驗值擬合良好，說明數(shù)值模擬是成功的。

根據(jù)方程對最佳提取條件進行預測，結果見表3。

表3 最優(yōu)解預測Tab.3 Prediction of optimum solution

從表3可以看出，擬合的方程預測的最優(yōu)解與正交試驗極差和方差的分析結果基本一致。由于在試驗范圍內(nèi)，液料比對提取率的影響不顯著，綜合考慮工藝成本，最終確定最佳工藝條件為乙醇濃度65%、超聲時間32 min、超聲溫度41℃和液料比10 mL/g。為了確認擬合方程預測的最優(yōu)組合的可信性，進行優(yōu)化組合的驗證試驗，測得此條件下100μL提取液的DPPH自由基清除率為66.8%，與方程的預測值接近，重復試驗相對偏差為1.82%（n=3），說明方程優(yōu)化的超聲提取工藝條件可信。

2.4 山竹果皮提取物抗氧化活性初步分析

圖2 山竹果皮提取物清除DPPH自由基的能力Fig.2 Free-radical scavenging activity of the extracts from mangosteen pericarp on DPPH assay

山竹果皮的抗氧化能力是由多種物質(zhì)共同作用的結果，僅有部分物質(zhì)結構組成已被鑒定，但仍有一些成分結構及其存在方式仍不明確。由于植物成分的體外抗氧化能力大部分與酚類化合物有關，因此，將最優(yōu)化提取條件下得到的提取液濃縮至干，干燥物溶于乙醇，測定了總酚含量，經(jīng)計算干燥物總酚含量為492.3 mg/g兒茶素。為了評價山竹果皮乙醇提取物的抗氧化能力，對不同濃度的兒茶素和乙醇提取液干燥物樣品清除DPPH自由基能力、抑制β胡蘿卜素漂白的能力進行了測定，結果分別如圖2和圖3所示。從圖2可以看出，乙醇提取物的對DPPH自由基的清除率隨濃度的增加而增大，經(jīng)計算，其對DPPH自由基清除的IC50值為8.4 μg/mL，與公認的天然抗氧化劑兒茶素的IC50值接近（7.6μg/mL）;從圖3可以看出，乙醇提取物對β－胡蘿卜素漂白的抑制率隨濃度的增加而增大，經(jīng)計算，其對β－胡蘿卜素漂白抑制的IC50值為 52.6μg/mL，而兒茶素的 IC50值大于200 μg/mL，說明山竹果皮提取物具有較強的抗氧化能力。

圖3 山竹果皮提取物對β－胡蘿卜素漂白的抑制能力Fig.3 Inhibitory effect of the extracts from mangosteen pericarp on β-carotene bleaching

3 結束語

利用DPPH自由基清除能力作為抗氧化性成份的提取指標，采用正交試驗優(yōu)化了山竹中抗氧化活性成分的提取工藝條件，即最佳工藝條件為乙醇濃度65%、超聲時間32 min、超聲溫度41℃和液料比10 mL/g。山竹果皮提取物具有較高的清除DPPH自由基和對β－胡蘿卜素漂白的抑制能力，其具體抗氧化成份有待于進一步研究，并評估其抗氧化應用的可行性。

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