李?lèi)?ài)琳，柏興華，鄧博雅，姜彥多，李光

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科，沈陽(yáng) 110001；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，沈陽(yáng) 110001；3.中國(guó)人民解放軍第二零二醫(yī)院病理科，沈陽(yáng) 110003）

LKB1（liver kinase B1，又稱(chēng) STK11）基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過(guò)磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMP-activated proteinkinase，AMPK）途徑，下調(diào)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 （mammalian target of rapamycin，mTOR）活性，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制血管新生，是目前公認(rèn)的抑癌基因［1～4］。在肺癌、宮頸癌等多種腫瘤中存在該基因的體細(xì)胞突變，其突變導(dǎo)致LKB1失活或下調(diào)，AMPK蛋白質(zhì)不能正常激活，不再繼續(xù)向mTOR發(fā)出抑制信號(hào)，導(dǎo)致細(xì)胞在能量不足的情況下仍保持生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展［1，5，6］。Contreras 等［7，8］報(bào)道：在鼠模型中LKB1基因突變導(dǎo)致的LKB1表達(dá)下調(diào)引起高侵襲性子宮內(nèi)膜樣腺癌的發(fā)生，而且LKB1表達(dá)缺失的子宮內(nèi)膜樣腺癌對(duì)mTOR抑制劑雷帕霉素高度敏感［9］。目前，LKB1蛋白在人類(lèi)子宮內(nèi)膜樣腺癌組織的表達(dá)情況及其對(duì)子宮內(nèi)膜樣腺癌發(fā)生的影響及與臨床病理因素之間的關(guān)系尚不清楚。本研究擬應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)LKB1在子宮內(nèi)膜樣腺癌及子宮內(nèi)膜單純?cè)錾M織中的表達(dá)情況，并分析其與子宮內(nèi)膜樣腺癌臨床病理特征及腫瘤微血管密度（microvessel density，MVD）的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

50例子宮內(nèi)膜樣腺癌組織來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院及中國(guó)人民解放軍第二零二醫(yī)院2006年1月至2010年1月進(jìn)行手術(shù)治療并經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診的手術(shù)標(biāo)本。參照國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（Federation International of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）2009年分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期26例，Ⅱ期11例，Ⅲ期 13例；其中高分化（G1）15例，中分化（G2）19例，低分化（G3）16例。所有標(biāo)本均為原發(fā)性腫瘤，術(shù)前未接受放化療或激素治療?；颊吣挲g31～66歲，平均54.98歲。同時(shí)選取在中國(guó)人民解放軍第二零二醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的病理診斷為子宮內(nèi)膜單純性增生的30例子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行對(duì)照研究。

1.2 主要試劑

濃縮型兔抗人多克隆抗體LKB1（1︰200；Abcam公司，美國(guó)）；即用型鼠抗人單克隆抗體CD34（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司）；SP試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司）；DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司）。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

組織蠟塊行4 μm厚連續(xù)切片，石蠟切片常規(guī)脫蠟。采用鏈霉素抗生素蛋白—過(guò)氧化物酶（SP）法檢測(cè)LKB1蛋白表達(dá)，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用雙盲閱片法進(jìn)行結(jié)果判定：細(xì)胞質(zhì)染成淺黃色、黃色或棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞。在10個(gè)高倍視野下（×400）確定細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽(yáng)性率百分比。染色強(qiáng)度評(píng)分：0分：無(wú)色；1分：淺黃色；2分：黃色；3分：棕黃色。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分：0分：0%，1分：1%～25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分＞75%。2項(xiàng)合計(jì)乘積為標(biāo)本的分值，劃分為2組：陰性：0～3分；陽(yáng)性：≥4分。MVD計(jì)數(shù)：在低倍鏡下挑選標(biāo)本中腫瘤血管密集區(qū)，在高倍鏡視野下（×400）隨機(jī)選擇4個(gè)視野，計(jì)數(shù)CD34陽(yáng)性的血管數(shù)，計(jì)數(shù)后以±s表示。在比較LKB1表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣腺癌MVD的聯(lián)系時(shí)，根據(jù)MVD值將腫瘤分為＜20、20～40、＞40 組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析腫瘤組及對(duì)照組LKB1表達(dá)差異，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)及Spearman非參數(shù)相關(guān)分析評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中LKB1表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)和MVD的相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LKB1在子宮內(nèi)膜樣腺癌、子宮內(nèi)膜單純性增生組織中的表達(dá)及定位

LKB1蛋白在子宮內(nèi)膜樣腺癌、子宮內(nèi)膜單純性增生組織中均有表達(dá)，其陽(yáng)性染色呈棕黃色顆粒彌漫性分布于細(xì)胞質(zhì)（圖1）。子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中LKB1表達(dá)陽(yáng)性率［42%（21/50）］明顯低于子宮內(nèi)膜單純性增生組織［66.7%（20/30）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.033）。

2.2 LKB1的表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣腺癌臨床病理特征及MVD的相關(guān)性

LKB1的表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣腺癌的病理分級(jí)、肌層浸潤(rùn)相關(guān)，而與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FIGO分期無(wú)關(guān)（P＞0.05）。在病理分級(jí)G3的患者中LKB1的表達(dá)陽(yáng)性率低于G1+G2的患者（18.8%vs 52.9%，P=0.022）；在肌層浸潤(rùn)≥1/2的患者中LKB1的表達(dá)陽(yáng)性率低于肌層浸潤(rùn)＜1/2的患者（30.0%vs 45.0%，P=0.035）。此外，LKB1的表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣腺癌的MVD呈負(fù)相關(guān)，MVD值高的子宮內(nèi)膜樣腺癌組織里L(fēng)KB1表達(dá)下調(diào)（r=-0.374，P=0.030）。見(jiàn)表1及圖2。

表1 LKB1表達(dá)與腫瘤病理參數(shù)及MVD的關(guān)系Tab.1 Relationship between expression of LKB1 and clinicopathological parameters，MVD in endometrial cancer patients

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤，以來(lái)源于子宮內(nèi)膜腺體的腺癌最常見(jiàn)，其致癌機(jī)制與癌基因、抑癌基因和DNA損傷修復(fù)基因的異常表達(dá)有關(guān)［10］。本研究結(jié)果表明：LKB1蛋白在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達(dá)低于單純子宮內(nèi)膜增生組織中，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.033）。Contreras等［7］發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜上皮LKB1突變的小鼠模型中，有53%（8/15）雌鼠在55周齡時(shí)發(fā)生子宮內(nèi)膜樣腺癌，認(rèn)為L(zhǎng)KB1表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致雌鼠子宮內(nèi)膜樣腺癌發(fā)病率升高，提示LKB1蛋白可能抑制子宮內(nèi)膜樣腺癌發(fā)生，并推測(cè)其在人類(lèi)子宮內(nèi)膜樣腺癌中也存在同樣作用。此外，在乳腺癌及肺癌等其他腫瘤中，也觀(guān)察到腫瘤組織中LKB1蛋白的表達(dá)明顯降低［11，12］。以上結(jié)果均與本研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示：LKB1的表達(dá)下調(diào)與子宮內(nèi)膜樣腺癌低分化相關(guān)。Ji等［12］在肺癌中也證實(shí)LKB1表達(dá)缺失導(dǎo)致肺鱗癌的分化降低。但Contreras等［7］在LKB1表達(dá)下調(diào)的雌鼠中觀(guān)察到高分化子宮內(nèi)膜樣腺癌的發(fā)生，也有LKB1表達(dá)與腫瘤分化無(wú)關(guān)的報(bào)道。這些結(jié)果的不一致可能與不同物種、疾病和樣本量有關(guān)，其機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。本研究結(jié)果顯示：LKB1的表達(dá)下調(diào)與子宮內(nèi)膜樣腺癌的肌層浸潤(rùn)深度呈正相關(guān)，這與Contreras等［7］報(bào)道的LKB1表達(dá)下調(diào)促進(jìn)子宮內(nèi)膜樣腺癌高侵襲性的結(jié)果一致，也與LKB1在肺癌和乳腺癌中的角色相符［11，12］。但本研究中并未發(fā)現(xiàn)LKB1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO分期的關(guān)系。

Zhuang等［11］報(bào)道在人類(lèi)乳腺癌中LKB1蛋白過(guò)表達(dá)可以降低MVD，推測(cè)LKB1可能通過(guò)抑制VEGF表達(dá)從而抑制血管新生。本研究發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜樣腺癌中LKB1的表達(dá)上調(diào)與腫瘤組織MVD呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)LKB1可能抑制子宮內(nèi)膜樣腺癌血管生成過(guò)程，但此機(jī)制有待進(jìn)一步研究證明。

綜上所述，LKB1蛋白表達(dá)下調(diào)與子宮內(nèi)膜樣腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，LKB1蛋白表達(dá)的檢測(cè)有可能成為子宮內(nèi)膜樣腺癌早期診斷的分子標(biāo)志，同時(shí)也可能用于子宮內(nèi)膜樣腺癌侵襲能力的預(yù)測(cè)。盡管對(duì)LKB1抑癌基因在子宮內(nèi)膜樣腺癌發(fā)生、侵襲和血管生成中的作用有了初步認(rèn)識(shí)，但其詳細(xì)的作用機(jī)制仍未完全明確，它在判斷分期、轉(zhuǎn)移和預(yù)后中的價(jià)值也有待于進(jìn)一步研究。

［1］Shackelford DB，Shaw RJ.The LKB1-AMPK pathway：metabolism and growth control in tumour suppression［J］.Nat Rev Cancer，2009，9（8）：563-575.

［2］Meric-Bernstam F，Gonzalez-Angulo AM.Targeting the mTOR signaling network for cancer therapy ［J］.J Clin Oncol，2009，27（13）：2278-2287.

［3］趙曉，李玉霞，凌焱，等.20例中國(guó)Peutz-Jeghers綜合征患者STK11基因編碼區(qū)突變分析 ［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（4）：511-514.

［4］胡新華，楊軍，張志深，等.反義mTOR基因局部轉(zhuǎn)染對(duì)移植靜脈內(nèi)膜增生的影響［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，36（2）：163-165.

［5］Ylikorkala A，Rossi DJ，Korsisaari N，et al.Vascular abnormalities and deregulation of VEGF in Lkb1-deficient mice ［J］.Science，2001，293（5533）：1323-1326.

［6］Katajisto P，Vaahtomeri K，Ekman N，et al.LKB1 signaling in mesenchymal cells required for suppression of gastrointestinal polyposis［J］.Nat Genet，2008，40（4）：455-459.

［7］Contreras CM，Gurumurthy S，Haynie JM，et al.Loss of Lkb1 provokes highly invasive endometrial adenocarcinomas ［J］.Cancer Res，2008，68（3）：759-766.

［8］Contreras CM，Akbay EA，Gallardo TD，et al.Lkb1 inactivation is sufficient to drive endometrial cancers that are aggressive yet highly responsive to mTOR inhibitor monotherapy ［J］.Dis Model Mech，2010，3（3-4）：181-193.

［9］Lu KW，Wu W，Dave B，et al.Loss of tuberous sclerosis complex-2 function and activation of mammalian target of rapamycin signaling in endometrial carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2008，14（9）：2543-2550.

［10］崔開(kāi)宇，孔憲超.腫瘤干細(xì)胞在子宮內(nèi)膜癌的診斷與治療中的研究進(jìn)展［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33（2）：280-283.

［11］Zhuang ZG，Di GH，Shen ZZ，et al.Enhanced expression of LKB1 in breast cancer cells attenuates angiogenesis，invasion，and metastatic potential［J］.Mol Cancer Res，2006，4（11）：843-849.

［12］Ji H，Ramsey MR，Hayes DN，et al.LKB1 modulates lung cancer differentiation and metastasis［J］.Nature，2007，448（7155）：807-810.