溫建立，劉勝華

（貴州省遵義醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院重癥監(jiān)護室，貴州 遵義 563002）

白細胞介素 13（interleukin-13，IL-13）是由活化的Th2細胞產生的調節(jié)過敏性炎癥的重要細胞因子［1，2］。IL-13通過結合二聚體受體激活下游信號通路，在支氣管哮喘（以下簡稱哮喘）發(fā)病中起重要作用。它可誘發(fā)氣道高反應性（airway high reactivity，AHR）IgE增高及黏液分泌增多等變態(tài)反應，同時與杯狀細胞增生和上皮細胞下纖維性化相關。研究表明，抑制IL-13可有效緩解哮喘癥狀。本研究擬采用B細胞表位技術制備抗IL-13抗體，探討抗IL-13抗體在哮喘治療中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

新西蘭大耳白兔和雄性BALB/C小鼠購自軍事醫(yī)學科學院動物中心；匙孔戚血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、雞卵蛋白（ovalbumin，OVA）、弗氏完全佐劑及弗式不完全佐劑購自Sigma公司；HRP標記羊抗兔IgG和ECL顯色試劑盒購自中杉金橋公司；細胞因子檢測試劑盒購自深圳晶美公司；其他試劑為國產或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 抗原表位分析：利用Ensembl數(shù)據庫和抗體設計軟件（Dragonfly）分析IL-13蛋白的二級結構、疏水性、親水性、抗原性及表面可及性等特點，選擇IL-13特異的片段作為擬合成的多肽，用于制備針對全蛋白的多克隆抗體。

1.2.2 免疫原及抗體純化凝膠制備：IL-13多肽片段由北京三博生物科技有限公司合成（純度＞98%），在合成多肽的C末端加一半胱氨酸用于與KLH的耦聯(lián)。將IL-13多肽片段溶于PBS緩沖液中，加入已溶解的KLH蛋白，0.3%的戊二醛耦聯(lián)2 h，甘氨酸溶液終止反應［3］。IL-13片段與活化凝膠耦聯(lián)：連接緩沖液（50 mmol/L Tris，5 mmol/L EDTA）溶解合成的 IL-13多肽，加入凝膠混合30 min，以封閉液封閉30 min完成抗體純化凝膠制備。

1.2.3 IL-13多克隆抗體制備：通過皮下多點注射方式免疫新西蘭大耳白兔，多肽-KLH耦聯(lián)物免疫劑量為100 μg/次。每2周免疫1次，共免疫4次。其中，首次免疫與弗氏完全佐劑乳化混勻，第2～4次免疫與弗式不完全佐劑乳化混勻。耳緣靜脈采血測定抗體效價，符合要求時，頸動脈取血，分離抗血清，保存于-20℃。

1.2.4 IL-13多克隆抗體純化：采用親和層析法?？寡褰涍^硫酸銨沉淀，PBS透析后與肽連接凝膠4℃混合過夜，裝柱。以甘氨酸溶液洗脫2～3次，合并收集的洗脫液，經過PBS透析后，BCA法測定蛋白濃度。純化的抗體分裝保存于-20℃。

1.2.5 抗體效價及特異性檢測：通過間接ELISA方法測定抗體效價。多肽-KLH耦聯(lián)物最終包被濃度為 0.5 μg/mL，包被量 100 μL/孔；5%脫脂奶粉 37 ℃封閉2 h，OBST洗滌3次，每次3～5 min；加入倍比稀釋的抗體孵育1 h，PBST洗滌；二抗為HRP標記的山羊抗兔IgG，37℃反應30 min；PBST充分洗滌后顯色5～10 min，2 mol/L硫酸終止反應。在450 nm波長處測OD值。以S/N>2.1為陽性值。

1.2.6 動物哮喘模型建立及分組：取6～8周齡雄性BALB/c小鼠，每只小鼠于第1天和第8天腹腔注射30 μg OVA（溶于 100 μL PBS）和等體積氫氧化鋁，以后每隔1周霧化吸入5%OVA，20 min/次，共4次。根據哮喘激發(fā)前尾靜脈注射抗體不同將小鼠分為：（1）兔IgG組：霧化吸入前1 h靜脈注射兔IgG（20 μg/只）；（2）IL-13抗體組：霧化吸入前 1 h靜脈注射兔 IL-13 多克隆抗體（20 μg/只）；（3）PBS 組：霧化吸入前1 h靜脈注射等量PBS緩沖液。陰性對照組用生理鹽水代替OVA進行腹腔注射。

1.2.7 支氣管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid，BALF）細胞計數(shù)及細胞因子水平檢測：給予小鼠氣管插管，用預冷的PBS緩沖液灌洗肺組織2次，每次1 mL，收集合并灌洗液，4℃1 000 r/min離心5 min，分離上清和細胞沉淀。用0.8 mL Hank液重懸細胞沉淀，測定細胞總數(shù)。涂片，Wright-Giemsa染色，細胞分類計數(shù)。眼眶采血，離心分離血清，EILSA法測定小鼠血清中細胞因子水平，按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.8 肺組織切片檢查：取小鼠肺組織，10%甲醛緩沖液浸泡48 h，制成石蠟包埋切片，嗜依紅和蘇木精染色后觀察肺組織病理變化。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 多肽序列選擇

通過軟件對IL-13蛋白的二級結構、柔韌性、親水性、抗原性和表面可及性進行綜合分析，IL-13蛋白第12～26氨基酸序列LTKELIEELSNITQ可作為IL-13的抗原表位。

2.2 多肽抗體效價、純度及特異性檢測結果

將合成多肽與KLH耦聯(lián)并免疫新西蘭大耳白兔，ELISA法免疫3次檢測血清抗體效價達到1︰104。免疫周期結束后，采用親和層析方法純化抗體，抗體濃度達到3.25 g/mL；純化后抗體效價達到1︰105。

2.3 細胞計數(shù)和細胞因子檢測

細胞計數(shù)結果如表1所示：經OVA誘導哮喘后，IL-13組、兔IgG組和PBS組小鼠的BALF中細胞數(shù)量顯著高于陰性對照組小鼠（P<0.01）；IL-13抗體組的BALF中細胞數(shù)量少于PBS組和兔IgG組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），而兔IgG組和PBS組小鼠BALF中細胞總數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。提示IL-13參與哮喘發(fā)生，IL-13中和抗體可抑制哮喘病程發(fā)展。

表1 小鼠BALF中細胞計數(shù)及分類（n=8）Tab.1 Categorization and count of leucocytes in BALF of mice（n=8）

通過ELISA法測定BALF中細胞因子，結果如表2所示：與陰性對照組相比，PBS組和兔IgG組細胞因子 IL-4、IL-5顯著升高（P<0.01），而 γ-IFN 顯著降低（P<0.01）；IL-13抗體組BALF中IL-4、IL-5顯著低于PBS組和兔IgG組（P<0.05），γ-IFN明顯高于PBS組和兔IgG組（P<0.05），進一步證實了IL-13抗體的中和作用。

表2 小鼠BALF中細胞因子含量（pg/mL，n=8）Tab.2 Cytokine levels of BALF in mice（pg/mL，n=8）

2.4 肺組織病理檢查結果

病理檢查結果如圖1所示：OVA誘導哮喘組（IL-13組、兔IgG組、PBS組）與陰性對照組比較，支氣管和血管炎癥及肺氣腫程度明顯。IL-13抗體組小鼠支氣管和肺泡炎癥較兔抗IgG組和PBS組明顯減輕。

3 討論

支氣管哮喘是由肥大細胞、嗜酸性粒細胞和T淋巴細胞等多種細胞參與的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為氣道高反應和氣道非特異性炎性反應。目前主要應用激素治療哮喘，但激素治療有一定的缺陷，如容易產生依賴性和耐藥性。同時，激素作用的非特異性也限制了其應用。因此，尋找新的治療途徑成為哮喘研究的熱點。

研究認為，Th2細胞因子IL-13與哮喘病情發(fā)展密切相關［4］，它能促進趨化因子產生，上皮下纖維化，杯狀細胞增生及氣道黏液增多，并激活中性粒細胞和肥大細胞，參與氣道重建。隨著人們對IL-13研究的深入，IL-13在哮喘中的作用日益受到人們的重視，探索抑制IL-13的方法可為治療哮喘提供新的途徑。研究表明，阻斷IL-13可緩解哮喘癥狀。Lively等［5］發(fā)現(xiàn)，通過IL-13 RNA干擾可減弱氣道炎癥和氣道高反應，Lee等［6］利用化學修飾干擾RNA也得到類似結果，Bree等［7］通過IL-13抗體阻斷IL-13可改善食蟹猴哮喘癥狀，Ma等［8］利用IL-13肽段制備的疫苗能夠減輕氣道炎癥狀。

本研究通過序列分析選擇了IL-13特有的抗原表位，與KLH耦聯(lián)制備抗IL-13抗體?？贵w效價達到1︰105，通過親和層析方法獲得的抗體純度達到80%以上，且該抗體能特異識別IL-13全蛋白，而不與其他蛋白發(fā)生反應，說明通過抗原表位制備的抗體具有較高特異性。用制備的抗體治療小鼠哮喘模型，結果表明該抗體能有效減輕IL-13引起的炎性反應，說明制備的抗體能夠中和IL-13，緩解哮喘癥狀。

［1］Kasaian MT，Tan XY，Jin M，et al.Interleukin-13 neutralization by two distinct receptor blocking mechanisms reduces immunoglobulin E responses and lung inflammation in cynomolgus monkeys［J］.Pharmacol Exp Ther，2008，325（3）：882-892.

［2］Kearley J，Buckland KF，Mathie SA，et al.Resolution of allergic inflammation and airway hyperreactivity is dependent upon disruption of the T1/ST2-IL-33 pathway［J］.Am J Respir Crit Care Med，2009，179（9）：772-781.

［3］朱風尚，黃志剛，胡鶯，等.抗PIWIL2蛋白多克隆抗體的制備、鑒定及初步應用［J］.第二軍醫(yī)大學學報，2008，9（29）：1034-1037.

［4］Vogel G.Interleukin 13 is key role in asthma shown ［J］.Science，1998，282（5297）：2168-2169.

［5］Lively TN，Kossen K，Balhorn A，et al.Effect of chemically modified IL-13 short interfering RNA on development of airway hyperresponsiveness in mice［J］.J Allergy Clin Immunol，2008，121（1）：88-94.

［6］Lee CC，Huang HY，Chiang BL.Lentiviral-mediated interleukin-4 and interleukin-13 RNA interference decrease airway inflammation and hyperresponsiveness［J］.Hum Gene Ther，2011，22 （5）：577-586.

［7］Bree A，Schlerman FJ，Wadanoli M，et al.IL-13 blockade reduces lung inflammation after Ascaris suum challenge in cynomolgus monkeys［J］.J Allergy Clin Immunol，2007，119（5）：1251-1257.

［8］Ma Y，HayGlass KT，Becker AB，et al.Novel recombinant interleukin-13 peptide-based vaccine reduces airway allergic inflammatory responses in mice［J］.Am J Respir Crit Care Med，2007，176（5）：439-445.