西藏飛蝗蟲糞粗提物的成分分析及其活性測定

王海建，李彝利，李 慶，*，楊 剛，匡健康，蔣春先，楊群芳

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130;2.四川甘孜州農(nóng)業(yè)局，康定 626000)

西藏飛蝗Locusta migratoria tibetensis(Chen)是青藏高原獨(dú)有的飛蝗亞種，分布在我國青海省南部、川西高原和西藏自治區(qū)，主要危害青稞、玉米、小麥等禾本科作物及牧草等。它與東亞飛蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)、亞洲飛蝗Locusta migratoria migratoria(Linnaeus)一起被稱為我國的“三大飛蝗”［1］。近年來西藏飛蝗在西藏、川西高原和青海玉樹等地發(fā)生危害十分嚴(yán)重，且有蔓延的趨勢，給當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)牧業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［2］。自1963年陳永林訂立西藏飛蝗亞種以來［3］，我國對(duì)西藏飛蝗的研究主要集中在形態(tài)描述、生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性等方面［4-8］。如李慶等對(duì)西藏飛蝗生活史、抗寒性、產(chǎn)卵習(xí)性以及西藏飛蝗對(duì)溫度和紫外輻射的適應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了研究［4-7］，楊群芳等對(duì)西藏飛蝗的食性進(jìn)行了研究［8］。

由于西藏飛蝗主要滋生于偏遠(yuǎn)民族地區(qū)，從高原藏族宗教文化和環(huán)境保護(hù)等方面考慮，單靠化學(xué)方法來防治西藏飛蝗可行性低，需要從生態(tài)治理等方面著手。利用信息化合物監(jiān)測和防治廣泛分布的蝗蟲，是可持續(xù)蝗災(zāi)治理的新理念［9-11］。西藏飛蝗危害嚴(yán)重的主要原因之一在于其群集性。昆蟲聚集信息素是由昆蟲產(chǎn)生，并且能夠引起同種昆蟲產(chǎn)生聚集行為反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)，在昆蟲群集中起著重要作用［12］。關(guān)于蝗蟲聚集信息素的研究報(bào)道多見于非洲飛蝗Locusta migratoria migratorioides(Reiche＆Fairmaire)［13］、沙漠蝗(Schistocerca gregaria(Forsk?l))［13-14］和東亞飛蝗［15］?，F(xiàn)已證明聚集信息素對(duì)于蝗蟲的型變、群集起到主要的調(diào)節(jié)和控制作用?；认x聚集信息素可存在于糞便、卵囊、蟲體及泡沫等部位［16-22］。不同種類蝗蟲聚集信息素組分和含量存在差異，同種蝗蟲不同發(fā)育階段、不同性別之間也存在差異。Torto等人證實(shí)沙漠蝗聚集信息素表現(xiàn)出明顯的階段性差異和性別差異，其體表分泌2種不同聚集信息素:一類由蝗蝻釋放只對(duì)蝗蝻作用，另一類由成蝗釋放且只對(duì)成蝗作用，且兩類信息素的成分不盡相同［18-19］。Njagi等研究表明散居型沙漠蝗聚集信息素中缺少群居型主要的苯乙腈，并且群居型雄成蟲聚集信息素在維持種群聚集及使散居型向群居型轉(zhuǎn)變過程中起著重要作用［20］。石旺鵬等［23-24］和郭志永等［25］研究表明東亞飛蝗聚集信息素主要存在于糞便中，其5齡蝗蝻與成蟲之間、雌雄成蟲之間的糞便揮發(fā)物化學(xué)組分基本相似，但是各成分的組成比例存在差異，而且包含多種電生理活性物質(zhì)。Yu等［26］利用氣相色譜技術(shù)證實(shí)東亞飛蝗成蟲糞便揮發(fā)物中含有30多種化合物，并通過質(zhì)譜分析結(jié)果和保留時(shí)間鑒定出9種能夠激起雄成蟲觸角電位反應(yīng)的化合物。關(guān)于西藏飛蝗聚集信息素的研究國內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道。本文采用自制Y型嗅覺儀、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)和觸角電位反應(yīng)(EAG)等方法對(duì)西藏飛蝗蟲糞粗提物進(jìn)行了活性測定和成分分析，以期為進(jìn)一步研究西藏飛蝗聚集機(jī)制及利用聚集信息素對(duì)西藏飛蝗進(jìn)行生態(tài)治理提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從四川甘孜州理塘縣采回西藏飛蝗低齡蝗蝻(群居型顏色為黑褐色至黑色，散居型為草綠色)，在實(shí)驗(yàn)室用新鮮玉米葉(雅玉二號(hào))飼養(yǎng)成生長情況一致的群居型和散居型蝗蟲供試。飼養(yǎng)條件為溫度(25±1)℃，相對(duì)濕度為60%—70%，光周期為12/12(L/D)。為了避免西藏飛蝗發(fā)生型變，將群居型和散居型蝗蝻分別放在不同房間的人工氣候箱中以25頭/籠和1頭/籠進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，以獲得群居型和散居型蝗蟲。同時(shí)，每天收集蝗蟲糞便，直到成蟲20d。將每天收集到的糞便清除干凈雜質(zhì)并用鋁箔紙包好，放入－20℃冰箱。供試前將每一齡期糞便5g/包混在一起。文中低齡蝗蝻指1—2齡蝗蝻，高齡蝗蝻指3—5齡蝗蝻。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 西藏飛蝗蟲糞粗提物的制備

溶劑直接浸提法取充分研磨的西藏飛蝗糞便5g置于100mL錐形瓶，加入50mL乙醇充分振蕩，1h后過濾得粗提物，將粗提物置于冰浴中經(jīng)N2濃縮后，置于－20℃冰箱保存待測。丙酮和二氯甲烷提取采用乙醇相同的方法，正己烷浸提需在65℃水浴中加熱。

超聲波提取法取充分研磨的西藏飛蝗糞便5g置于100mL錐形瓶，加入50mL乙醇，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理1h后，過濾得粗提物，將粗提物置于冰浴中經(jīng)N2濃縮后，置于－20℃冰箱保存待測。

1.2.2 西藏飛蝗對(duì)其蟲糞粗提物的行為反應(yīng)

采用自制Y型嗅覺儀進(jìn)行行為反應(yīng)測定。Y型嗅覺儀主管長50cm，兩側(cè)臂分別長30cm，內(nèi)徑7cm，兩臂夾角為75°，Y型嗅覺儀兩側(cè)臂分別通過Teflon管與樣品室連接，一個(gè)樣品室內(nèi)放入充分浸潤西藏飛蝗蟲糞粗提物的脫脂棉球，另一個(gè)樣品室中放入充分浸潤同體積提取溶劑的脫脂棉球作對(duì)照;采用大氣采集儀抽氣，使每側(cè)臂氣流速度均控制在250mL/min。從Y型嗅覺儀主管末端接入西藏飛蝗試蟲1頭，每次觀察3min。如果試蟲釋放后在某一側(cè)臂的前臂(即側(cè)臂與氣味源連接處的1/2處)活動(dòng)時(shí)間持續(xù)超過1min，就記為試蟲對(duì)該側(cè)臂所連接的氣源有趨向性;如果試蟲釋放后，在整個(gè)3min觀察時(shí)間內(nèi)，在任一側(cè)臂的前臂均未持續(xù)活動(dòng)超過1min，就記為該試蟲在整個(gè)試驗(yàn)中對(duì)氣源無趨向性。

行為反應(yīng)測定在溫度(25±1)℃的室內(nèi)進(jìn)行。每處理試蟲10頭，重復(fù)3次。每測試2頭試蟲時(shí)調(diào)換一下Y型管兩側(cè)臂的方向，以消除幾何位置對(duì)試蟲行為可能產(chǎn)生的影響。每處理測試完后，用75%的酒精清洗嗅覺儀，吹風(fēng)機(jī)吹干，靜置30min后再測定。

1.2.3 西藏飛蝗蟲糞粗提物成分分析

利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析西藏飛蝗不同類型、性別、齡期糞便粗提物的成分。氣相色譜條件:HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30cm×0.25mm×25μm)，無分流進(jìn)樣;載氣:氦氣(He);壓力:20kPa。具體的升溫程序:初始溫度為60℃，保留3min;然后以4℃/min升溫至80℃，保留3min;再以20℃/min升溫至180℃，保留1min;最后以4℃/min升溫至220℃，保留5min。進(jìn)樣口溫度為250℃，GC-MS接口溫度為270℃，進(jìn)樣量2μL。質(zhì)譜條件:EI離子源，離子源溫度150℃，四極桿溫度230℃，電離能為70 eV，掃描范圍(m/z)35—550amu，載氣流速:1mL/min。用WILEY軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析，2min后開始采集數(shù)據(jù)，所得質(zhì)譜圖直接與WILEY數(shù)據(jù)庫檢出的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對(duì)照，并通過查閱相關(guān)資料以確定其化學(xué)組分。

1.2.4 西藏飛蝗對(duì)人工合成化合物觸角電位反應(yīng)

試驗(yàn)時(shí)將西藏飛蝗觸角沿基部切下，并將觸角頂部切下2—3mm，然后將基部置于參考電極，端部置于記錄電極上。取一定量的化合物滴于2cm×0.5cm的濾紙片上，并置于1000μL移液槍頭中。設(shè)定純化空氣流速為100mL/min，樣品刺激時(shí)間為300ms，兩次刺激間的時(shí)間間隔為2min。試驗(yàn)所用觸角電位儀由荷蘭Syntech公司生產(chǎn)，測定所需軟件也由該公司提供。

每處理測試觸角5根，每根刺激5次。為消除觸角適應(yīng)所導(dǎo)致的偏差，測試前后均使用乙醇做空白對(duì)照，將每一樣品測定值的平均數(shù)除以前后2次對(duì)照測定值的平均值即得EAG凈反應(yīng)值。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Duncan氏新復(fù)極差測驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 西藏飛蝗蟲糞粗提物提取方法比較

西藏飛蝗散居型和群居型4齡蝗蝻對(duì)不同方法提取的蟲糞粗提物的趨向率存在差異(圖1，圖2)。除群居型4齡蝗蝻對(duì)群居型高齡蝗蝻蟲糞粗提物外，散居型和群居型4齡蝗蝻對(duì)不同來源蟲糞粗提物的趨向率均表現(xiàn)為乙醇浸提法＞丙酮浸提法＞二氯甲烷浸提法＞正己烷浸提法＞乙醇超聲波提取法。乙醇浸提法提取的蟲糞粗提物活性顯著高于正己烷浸提法和乙醇超聲波提取法。群居型4齡蝗蝻對(duì)群居型高齡蝗蝻乙醇超聲波提取法的蟲糞粗提物趨向率略高于正己烷浸提法，但兩者之間無顯著差異。因此，在五種方法中乙醇浸提法是提取西藏飛蝗蟲糞粗提物的最佳方法，后續(xù)試驗(yàn)中蟲糞粗提物均用該方法得到。

圖1 西藏飛蝗散居型4齡蝗蝻對(duì)不同蟲糞粗提物的趨向率Fig.1 The taxis ratio of solitary 4th instars L.migratoria tibitensis Chen to different fecal extract

圖2 西藏飛蝗群居型4齡蝗蝻對(duì)不同蟲糞粗提物的趨向率Fig.2 The taxis ratio of gregarious 4th instars L.migratoria tibitensis Chen to different fecal extract

2.2 西藏飛蝗對(duì)不同蟲糞粗提物的行為反應(yīng)

西藏飛蝗對(duì)其蟲糞粗提物均有一定趨向性，但對(duì)不同蟲態(tài)的蟲糞粗提物趨向性存在顯著差異(表1)。其中，群居型雄成蟲對(duì)其自身蟲糞粗提物趨向率最高為76.67%，而群居型4齡蝗蝻對(duì)群居型低齡蝗蝻的蟲糞粗提物趨向率最低，僅為36.67%。

西藏飛蝗各蟲態(tài)對(duì)群居型成蟲蟲糞粗提物的趨向性明顯高于對(duì)其他蟲態(tài)蟲糞粗提物的趨向性;且對(duì)群居型雄成蟲蟲糞粗提物的趨向性略高于群居性雌成蟲，但對(duì)兩者并無顯著差異。各蟲態(tài)對(duì)群居型高齡蝗蝻蟲糞粗提物的趨向性略高于低齡，但對(duì)兩者并無顯著差異。說明群居型西藏飛蝗蟲糞粗提物活性隨蟲齡增加而增強(qiáng)。西藏飛蝗對(duì)散居型高齡蝗蝻的趨向性略高于低齡，對(duì)雄成蟲的趨向性略高于雌成蟲，但西藏飛蝗對(duì)散居型各蟲態(tài)蟲糞粗提物的趨向性之間無顯著性差異。

各蟲態(tài)西藏飛蝗對(duì)低齡蝗蝻蟲糞粗提物的趨向性均較低，都小于或等于50%;對(duì)成蟲蟲糞粗提物的趨向性無顯著性差異。散居型蝗蟲對(duì)蝗蝻蟲糞粗提物的趨向性高于同蟲態(tài)群居型蝗蟲對(duì)蝗蝻蟲糞粗提物的趨向性。除對(duì)散居型雄成蟲蟲糞粗提物外，雄成蟲對(duì)同一蟲糞粗提物的趨向性均高于雌成蟲。

表1 西藏飛蝗對(duì)不同蟲糞粗提物的趨向率(%)Table1 The taxis ratio of L.migratoria tibitensis Chen to different fecal extract(%)

2.3 西藏飛蝗不同蟲態(tài)蟲糞粗提物的成分分析

通過氣質(zhì)聯(lián)用分析可知，不同蟲態(tài)西藏飛蝗蟲糞粗提物共含有35種化合物，主要包含烯烴、醇、醛、酮和酚類等(表2)。不同蟲態(tài)蟲糞粗提物所含化合物數(shù)量及含量有所差別。雌性成蝗化合物種類最多，散居型蝗蝻化合物種類最少。從各化合物含量看，西藏飛蝗蟲糞粗提物主要成份為環(huán)己醇、2，5-二甲基吡嗪、2，6，6-三甲基環(huán)己烯-1，4-二酮、壬醛、苯甲醛、(E)-3，7，11，15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇、3-苯基丁-2-醇和 2，2'-亞甲基雙-(4-6-叔丁基苯酚)。另外，蝗蝻蟲糞粗提物中(3β，5α)-2-亞甲基-3-膽甾烷醇含量遠(yuǎn)高于成蝗。

2.4 西藏飛蝗對(duì)人工合成化合物的觸角電位反應(yīng)

對(duì)西藏飛蝗蟲糞粗提物中含量較高的化合物及與東亞飛蝗聚集信息素相同的化合物進(jìn)行觸角電位反應(yīng)，結(jié)果見圖3。在0.04—4μL/mL濃度范圍內(nèi)，除對(duì)(E)-3，7，11，15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇觸角電位反應(yīng)不明顯外，西藏飛蝗試蟲對(duì)供試的人工合成化合物均有一定的電生理反應(yīng)，其變化趨勢大致可分為3類。第一類是苯甲醛、2，6，6-三甲基環(huán)己烯-1，4-二酮、4-(2，6，6-三甲基環(huán)己烯基)3-丁烯-2-酮、2，5-二甲基吡嗪和己醛。西藏飛蝗各蟲態(tài)對(duì)濃度為2μL/mL和4μL/mL的各化合物觸角電位反應(yīng)值均高于對(duì)照，且對(duì)濃度為2μL/mL的各化合物觸角電位反應(yīng)值均最高。第二類是2-己烯醛、環(huán)己醇、庚醛、苯甲醇、壬醛和癸醛等6種物質(zhì)。在0.04—4μL/mL濃度范圍，不同蟲態(tài)西藏飛蝗對(duì)同一化合物的電生理反應(yīng)變化趨勢不一致。如散居型雌性成蟲和散居型雄成蟲對(duì)環(huán)己醇的電生理反應(yīng)值隨環(huán)己醇濃度增大而增強(qiáng);但散居型和群居性蝗蝻對(duì)濃度為4μL/mL的環(huán)己醇電生理反應(yīng)值低于2μL/mL。第三類是2，2'-亞甲基雙-(4-6-叔丁基苯酚)、3-苯基丁-2-醇和1-乙基-3-甲基環(huán)戊烯。西藏飛蝗各蟲態(tài)對(duì)這3種化合物的電生理反應(yīng)均顯著高于對(duì)照，且隨物質(zhì)濃度增加，電生理反應(yīng)值顯著增加。就不同蟲態(tài)西藏飛蝗對(duì)同一物質(zhì)的反應(yīng)值來看，總體呈現(xiàn)出散居型強(qiáng)于群居性、成蟲強(qiáng)于若蟲，雄性強(qiáng)于雌性的趨勢。

3 討論

本文表明溶劑浸提法獲得的粗提物活性隨提取溶劑極性增強(qiáng)而增強(qiáng)，乙醇浸提法獲得的粗提物活性最強(qiáng)，丙酮次之。說明西藏飛蝗蟲糞粗提物組分主要為高極性和中極性的物質(zhì)，低極性的物質(zhì)較少。超聲波提取法在處理糞便的過程中由于溫度上升或震動(dòng)破壞了活性成分，故制備效果不理想。這與石旺鵬等的對(duì)東亞飛蝗糞便聚集信息素提取方法的研究結(jié)果報(bào)道一致［24］。

表2 GC-MS法鑒定的西藏飛蝗蟲糞粗提物成分及相對(duì)含量Table2 Chemical compounds and relative content in fecal volatile of L.migratoria tibitensis Chen identified by GC-MS

西藏飛蝗對(duì)不同蟲糞粗提物的行為反應(yīng)表明，西藏飛蝗蟲糞粗提物活性隨蟲齡增加，群居型成蟲蟲糞粗提物活性最強(qiáng)，雄成蟲蟲糞粗提物活性高于雌成蟲，推測成蟲蟲糞粗提物可能在維持種群聚集中起主要作用。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)散居型蝗蟲對(duì)蝗蝻蟲糞粗提物的趨向性高于群居型蝗蟲對(duì)蝗蝻蟲糞粗提物的趨向性。不同蟲態(tài)西藏飛蝗對(duì)同一人工合成化合物的觸角電位反應(yīng)也總體呈現(xiàn)散居型強(qiáng)于群居型、成蟲強(qiáng)于蝗蝻，雄性強(qiáng)于雌性的趨勢。一方面可能是由于散居型西藏飛蝗觸角上感受器數(shù)量較群居型更多，對(duì)寄主植物、產(chǎn)卵場所等的感知和定位能力更強(qiáng)［27］;另一方面群居型蝗蟲群集生活，對(duì)生活環(huán)境中的類似信息素存在一定的適應(yīng)性，因而對(duì)聚集信息素的敏感性不及散居型蝗蟲。

圖3 西藏飛蝗對(duì)不同濃度人工合成聚集信息素單質(zhì)的觸角電位反應(yīng)Fig.3 Electrophysiological responses of L.migratoria tibitensis Chen to different concentrations of synthetic active substance

現(xiàn)有關(guān)于沙漠蝗、非洲飛蝗和東亞飛蝗聚集信息素成分研究表明蝗蟲聚集信息素成份較為復(fù)雜。不同種類、同種不同生物型、不同性別、不同發(fā)育階段聚集信息素成分及作用對(duì)象均表現(xiàn)出明顯的差異［18-19，28］。西藏飛蝗成蟲較蝗蝻蟲糞粗提物中的化合物種類更多，表明隨蟲齡增長化合物種類增加。雌性可能由于生殖等原因，蟲糞粗提物化學(xué)組分最多，具體是何原因還有待進(jìn)一步深入研究。群居型和散居型成蟲、蝗蝻蟲糞粗提物中均有11種物質(zhì)與東亞飛蝗聚集信息素一致，依次為己醛、2-己烯醛、環(huán)己醇、庚醛、2，5-二甲基吡嗪、苯甲醇、苯甲醛、壬醛、癸醛、2，6，6-三甲基環(huán)己烯-1，4-二酮和 4-(2，6，6-三甲基環(huán)己烯基)3-丁烯-2-酮，但是比例有所不同。西藏飛蝗蟲糞粗提物中有些物質(zhì)未曾在東亞飛蝗糞便揮發(fā)物中發(fā)現(xiàn)，如(E)-3，7，11，15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇、3-苯基丁-2-醇、1-乙基-3-甲基環(huán)戊烯和2，2'-亞甲基雙-(4-6-叔丁基苯酚)等。西藏飛蝗蟲糞粗提物中未發(fā)現(xiàn)愈創(chuàng)木酚、鄰二甲氧基苯和苯酚這3種沙漠蝗和非洲飛蝗聚集信息素中存在的化合物。這可能與西藏飛蝗和東亞飛蝗、非洲飛蝗等隸屬不同亞種，且食物、生活條件不同有關(guān)。另外，本研究采用溶劑浸提法獲得的蟲糞粗提物中既含有揮發(fā)性成分，也具有非揮發(fā)性成分，這也是引起西藏飛蝗和其他飛蝗化合物不同的主要原因。因此，在后續(xù)研究中，需直接提取蟲糞取揮發(fā)性成分做進(jìn)一步研究。觸角電位反應(yīng)說明，雖然在西藏飛蝗各蟲態(tài)糞便聚集信息素中(E)-3，7，11，15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇含量較高，但并無電生理活性。其余物質(zhì)根據(jù)西藏飛蝗不同蟲態(tài)對(duì)不同濃度的反應(yīng)趨勢大體可分為3類，說明不同活性成分作用濃度不同。各化合物最適濃度及不同化合物混合作用時(shí)，達(dá)到最大聚集活性的各成分比例，各成分含量還需進(jìn)一步研究。在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，蝗蝻蟲糞粗提物中(3β，5α)-2-亞甲基-3-膽甾烷醇含量遠(yuǎn)高于成蝗，由于未購得該成分人工合成化合物，并未對(duì)該化合物進(jìn)行觸角電位反應(yīng)，該化合物含量在成若蝗中顯著不同是否是引起成蝗和蝗蝻蟲糞粗提物活性差異的主要原因還需進(jìn)一步研究。

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