玄香蘭 安昌善 周彩存

吉非替尼是表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI），是目前最常用的治療非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）的分子靶向藥物。由于吉非替尼對(duì)特殊患者的選擇性，僅部分NSCLC患者對(duì)吉非替尼有效，存在原發(fā)或獲得耐藥，這種耐藥機(jī)制不十分明確。新近研究[1,2]顯示，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor, HGF）及其受體MET參與NSCLC細(xì)胞對(duì)吉非替尼耐藥。本研究選擇NSCLC細(xì)胞EGFR突變型PC-9、PC9/R和EGFR野生型H292、A549，用HGF誘導(dǎo)這4株細(xì)胞，應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，Annexin V-FITC法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，利用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)c-Met及下游通道蛋白的表達(dá)，驗(yàn)證c-Met及下游信號(hào)通道參與HGF誘導(dǎo)不同基因型NSCLC細(xì)胞株對(duì)吉非替尼耐藥。

1 材料與方法

1.1 材料 人NSCLC細(xì)胞株P(guān)C9（EGFR突變型，敏感株）、H292（EGFR野生型，敏感株）、PC9/R（EGFR突變型，獲得性耐藥株）、A549（EGFR野生型，原發(fā)性耐藥株）均由上海市肺科醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；吉非替尼原料購(gòu)自濟(jì)南匯豐達(dá)化工有限公司；HGF購(gòu)自Humanzyme；MTT粉購(gòu)自AMRESCO；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit 1購(gòu)自美國(guó)BD；兔抗人p-Met（Tyr1349, 145 kDa）、c-Met（190/56 kDa），p-Akt（Ser473, 60 kDa）、Akt（59 kDa），Erk1（44 kDa），p-Stat3（Ser727, 92 kDa）、Stat3（92 kDa），GAPDH（35 kDa）購(gòu)自EPITOMICS，p-Erk1/2（Tyr202/Y204, 42/44 kDa）購(gòu)自CST，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自JECTION；NC膜購(gòu)自Whatman；ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自Thermo。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 分別將PC9、H292、PC9/R、A549細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37oC恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3-4天換液傳代1次。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化，每100 μL含細(xì)胞數(shù)為5×103個(gè)的細(xì)胞懸液接種于96孔板。細(xì)胞貼壁后，每孔內(nèi)加入干預(yù)藥物及細(xì)胞因子。72 h后，每孔內(nèi)加入20 μL MTT（5 mg/mL），放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。4 h后，1,200 rpm、10 min離心，棄上清液，每孔加入200 μL DMSO，搖床上混勻約30 min至結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)530 nm時(shí)OD值。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組平均OD值-空白組平均OD值）/（對(duì)照組平均OD值-空白組平均OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用細(xì)胞存活率做出量效曲線。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取1×105個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h。貼壁后棄原培養(yǎng)液，給予相應(yīng)藥物及細(xì)胞因子處理。72 h后，胰酶消化并收集全部細(xì)胞到5 mL試管，1,500 rpm、5 min，離心去上清液，生理鹽水洗滌1次。加入1×Binding Buffer調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，取100 μL（1×105個(gè)細(xì)胞）到新的5 mL試管。各管內(nèi)加入5 μL FITC和5 μL PI，室溫、避光15 min。上機(jī)前加入400 μL 1×Binding Buffer，1 h前進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，給予相應(yīng)處理后立即冰上裂解細(xì)胞，4oC、12,000 rpm、30 min、離心收集各組蛋白裂解液。用BCA蛋白定量法定量。取30 μg-40 μg蛋白經(jīng)8%-10% SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)印至NC膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育4oC過夜，TBST洗膜10 min、3次后二抗室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜5 min、5次后ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色、曝光成像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HGF刺激不同時(shí)間段c-Met及其下游通道蛋白水平的變化 以40 ng/mL HGF刺激細(xì)胞時(shí)間段分別為0 min、15 min、30 min、60 min，裂解細(xì)胞取蛋白進(jìn)行蛋白印跡。結(jié)果顯示，HGF可活化c-Met及其下游通道蛋白磷酸化，隨著時(shí)間的推移，各細(xì)胞中p-Met、p-Akt、p-Stat3、p-Erk1/2蛋白含量出現(xiàn)不同程度的變化。PC9，H292和PC9/R，A549細(xì)胞的最佳HGF刺激時(shí)間段分別于60 min、30 min、15 min時(shí)比其他時(shí)間段c-Met及其下游通道磷酸化蛋白表達(dá)明顯（圖1）。

2.2 吉非替尼或/和HGF處理的藥物濃度-生長(zhǎng)曲線 吉非替尼濃度分別取0 μmol/L、0.01 μmol/L、0.04 μmol/L、0.1 μmol/L、0.4 μmol/L、1 μmol/L、4 μmol/L、10 μmol/L、40 μmol/L、100 μmol/L，根據(jù)MTT法檢測(cè)結(jié)果，吉非替尼作用于HGF誘導(dǎo)PC9、H292、A549細(xì)胞的藥物濃度-細(xì)胞存活率曲線與非誘導(dǎo)曲線相比明顯往右側(cè)移位，PC9/R細(xì)胞則未見移位（圖2）。吉非替尼對(duì)HGF誘導(dǎo)PC9、H292細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）至少提高100倍，A549細(xì)胞的IC50至少提高2倍，PC9/R細(xì)胞的IC50則無明顯差異（表1）。

2.3 吉非替尼或/和HGF處理對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 每種細(xì)胞分為四個(gè)實(shí)驗(yàn)組：對(duì)照組（C）、HGF組（H）、吉非替尼組（G）、HGF和吉非替尼組（HG）。以40 ng/mL HGF與1 μmol/L吉非替尼單用或聯(lián)合作用48 h后檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。根據(jù)表2顯示，PC9、H292、A549細(xì)胞的HG組與G組相比，凋亡率明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PC9/R細(xì)胞的HG組與G組凋亡率無明顯差異（P＞0.05）。

2.4 吉非替尼或/和HGF處理對(duì)細(xì)胞c-Met及其下游蛋白表達(dá)的影響 首先細(xì)胞饑餓過夜，1 μmol/L吉非替尼處理24 h，繼續(xù)以40 ng/mL HGF刺激PC9細(xì)胞1 h、H292和PC9/R細(xì)胞30 min、A549細(xì)胞15 min后裂解細(xì)胞提取蛋白，進(jìn)行免疫印跡。根據(jù)免疫印跡結(jié)果，HGF均能刺激PC9、H292、PC9/R、A549細(xì)胞中p-Met、p-Akt、p-Stat3、p-Erk1/2的活性。吉非替尼與HGF共同處理時(shí)，不同細(xì)胞間c-Met及其下游通道蛋白表達(dá)有差異。在PC9、H292、A549細(xì)胞，吉非替尼均能抑制非HGF誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)p-Met、p-Akt、p-Stat3、p-Erk1/2的活性，而不能抑制HGF誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)p-Met、p-Akt、p-Stat3、p-Erk1/2的活性。在PC9/R細(xì)胞，吉非替尼均能抑制HGF非誘導(dǎo)及誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)p-Akt、p-Stat3、p-Erk1/2的活性。在4種細(xì)胞中，無論是否HGF誘導(dǎo)，吉非替尼均能抑制ErbB3的活化（圖3）。

表1 HGF誘導(dǎo)前后吉非替尼半數(shù)抑制濃度（IC50）Tab 1 Gefitinib IC50 before or after being induced by HGF

表2 HGF誘導(dǎo)耐藥對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Tab 2 The apoptosis in resistance induced by HGF

圖1 HGF（40 ng/mL）誘導(dǎo)不同時(shí)間c-Met及其下游通道磷酸化的表達(dá)Fig 1 The phosphorylation of Met and downstreams signaling pathways induced by HGF (40 ng/mL) in different time

圖2 吉非替尼或/和HGF處理的濃度-存活率曲線。A、B、D：HGF誘導(dǎo)時(shí)曲線往右移；C：HGF誘導(dǎo)時(shí)曲線無右移。Fig 2 The concentration-survival curve when treated with gefitinib or/and HGF. A, B, D: curve shifts right when induced by HGF; C: curve no shifts right when induced by HGF.

圖3 HGF誘導(dǎo)耐藥對(duì)Met及其下游通道蛋白的影響Fig 3 The phosphorylation of Met and downstreams signaling pathways in resistance induced by HGF

3 討論

EGFR-TKIs對(duì)部分特殊患者有效，非選擇的NSCLC患者有效率只有20%[3]。EGFR基因類型與EGFR-TKIs有效率有很大的相關(guān)性，突變型患者中70%-75%有效[4]，野生型患者中10%-15%有效[5]，存在原發(fā)或獲得性耐藥，提示并非所有突變株對(duì)吉非替尼敏感，也并非所有野生株對(duì)吉非替尼耐藥。本研究選擇的4種NSCLC細(xì)胞分別具有以下特點(diǎn)：PC9細(xì)胞是EGFR基因外顯子19缺失，故吉非替尼對(duì)其IC50值為（0.05±0.02）μmol/L；PC9/R細(xì)胞是PC9細(xì)胞誘導(dǎo)耐藥株，同樣存在EGFR基因外顯子19缺失，但吉非替尼對(duì)其IC50值為（7.19±1.05）μmol/L，比敏感株耐藥100倍以上；H292細(xì)胞是EGFR基因野生型，吉非替尼對(duì)其IC50值為（0.11±0.05）μmol/L；A549細(xì)胞同樣是EGFR基因野生型，但吉非替尼對(duì)其IC50值為（37.5±1.89）μmol/L。也就是說PC9和H292細(xì)胞是不同EGFR基因型的敏感株，PC9/R和A549是不同EGFR基因型的耐藥株。

EGFR二次突變（T790M）和MET基因擴(kuò)增是目前EGFR-TKIs獲得性耐藥的兩大主要分子機(jī)制，其他可能的機(jī)制有胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體過表達(dá)[6]、蛋白酪氨酸磷酸酶基因（PTEN）缺失[7]、HGF高表達(dá)[8]等，有待進(jìn)一步體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。HGF是成纖維細(xì)胞的衍生因子，在NSCLC患者血清中含量明顯升高，與腫瘤的侵襲狀態(tài)密切相關(guān)[9]。HGF與其特異性受體c-Met結(jié)合而發(fā)揮作用，異常的HGF/c-Met信號(hào)途徑與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、粘附、轉(zhuǎn)移、凋亡等因素相關(guān)。本研究中，除了PC9/R細(xì)胞，吉非替尼對(duì)PC9、H292、A549的生長(zhǎng)抑制作用呈濃度依賴性，HGF誘導(dǎo)后吉非替尼抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線往右移。HGF誘導(dǎo)后吉非替尼對(duì)PC9、H292、A549細(xì)胞的IC50值明顯升高，吉非替尼對(duì)HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率比非誘導(dǎo)細(xì)胞明顯減少。提示HGF明顯提高了吉非替尼IC50值，使不同基因型肺癌細(xì)胞存活率升高。

HGF與c-Met結(jié)合后c-Met發(fā)生自身磷酸化，激活細(xì)胞內(nèi)各種重要信號(hào)通路，最后調(diào)控細(xì)胞的一系列生命活動(dòng)。Met下游通道包括MAPK、PI3K/Akt 和c-Src/FAK、STAT等通路，其中MAPK通路主要調(diào)控細(xì)胞分散及增殖，PI3K/Akt通路主要調(diào)控細(xì)胞活力及存活，c-Src/FAK通路主要調(diào)控細(xì)胞粘附及轉(zhuǎn)移，STAT通路主要調(diào)控細(xì)胞形態(tài)發(fā)生。本文中HGF刺激不同時(shí)間段，HGF在短時(shí)間（15 min-60 min）內(nèi)即可活化c-Met、Akt、Stat3、Erk1/2，且其含量高低不一。分別與其他時(shí)間段比較，PC9細(xì)胞于1 h、H292和PC9/R細(xì)胞于30 min、A549細(xì)胞于15 min時(shí)c-Met及其下游通道蛋白磷酸化含量最高。

本文中，吉非替尼在無HGF刺激下明顯抑制PC9、H292、A549細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)Akt、Stat3、Erk1/2的活化，但在HGF誘導(dǎo)下不能抑制PC9、H292、A549細(xì)胞內(nèi)c-Met、Akt、Stat3、Erk1/2活化，同時(shí)檢測(cè)的非磷酸化的c-Met、Akt、Stat3、Erk1/2總量無明顯變化。說明c-Met及其下游通道蛋白磷酸化參與了吉非替尼耐藥機(jī)制。在PC9/R細(xì)胞中，HGF雖能活化c-Met及下游信號(hào)蛋白，但與吉非替尼共同處理時(shí)不能持續(xù)活化c-Met下游通道，這與MTT及凋亡結(jié)果相符，其原因有待進(jìn)一步研究。本文結(jié)果提示，HGF誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥需要上游蛋白的參與，也需要其下游信號(hào)蛋白的參與。Bean等[10]報(bào)道在吉非替尼獲得性耐藥患者中檢測(cè)到MET基因高擴(kuò)增，明確MET基因擴(kuò)增激活ErbB3/PI3K/Akt信號(hào)途徑，繞過吉非替尼治療的靶點(diǎn)，導(dǎo)致NSCLC對(duì)吉非替尼產(chǎn)生耐藥。本研究中，雖然HGF誘導(dǎo)c-Met/Akt信號(hào)途徑活化，但未見ErbB3活化，提示ErbB3可能不參與HGF誘導(dǎo)的不同基因型NSCLC細(xì)胞株對(duì)吉非替尼耐藥。