雷源源 綜述 吳一龍 審校

肺癌是我國目前發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌的80%-85%，分子靶點的發(fā)現(xiàn)及相應(yīng)靶向藥物的臨床應(yīng)用進一步開辟了NSCLC個體化治療的時代，但總體上NSCLC的5年生存率仍滯留在15%-20%左右。完全性切除的I期NSCLC，常規(guī)臨床方法檢測不到殘余腫瘤細胞的患者中仍有25%-30%患者最終會發(fā)生局部復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移[2,3]，這可能與肺癌患者早期即存在全身微轉(zhuǎn)移有關(guān)。這些微轉(zhuǎn)移灶存在于外周血、骨髓、淋巴結(jié)或漿膜腔中，在一定條件下增殖浸潤，引起腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移。NSCLC的微轉(zhuǎn)移主要包括淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移、骨髓腔微轉(zhuǎn)移、胸膜腔微轉(zhuǎn)移及外周血微轉(zhuǎn)移。分子生物學技術(shù)的發(fā)展將微轉(zhuǎn)移的檢測能力提高到了細胞和分子水平，也使檢測NSCLC微轉(zhuǎn)移灶用于預測療效和判定預后成為可能。

1 微轉(zhuǎn)移的概念

1869年，Ashworth首先報道了在1例腫瘤患者體內(nèi)檢測到循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells, CTCs）。腫瘤的微轉(zhuǎn)移（mircrometastasis）或隱匿性轉(zhuǎn)移（occult metastasis）是指惡性腫瘤在發(fā)展過程中，癌細胞播散并存活在淋巴結(jié)、骨髓、外周血及各組織器官中，但尚未形成顯性轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移部位也無任何臨床表現(xiàn)，采用影像學和常規(guī)病理方法難以檢測到的微量轉(zhuǎn)移，需要通過分子生物學的技術(shù)予以診斷[4]。

2 NSCLC微轉(zhuǎn)移的檢測方法

2.1 免疫組織化學法（immunohistochemistry, IHC） IHC是利用抗原與抗體間的特異性結(jié)合原理和特殊的標記技術(shù)，對組織和細胞內(nèi)的特定抗原或抗體進行定位、定性或定量檢測的一門技術(shù)。IHC主要用于NSCLC淋巴結(jié)及骨髓中微轉(zhuǎn)移灶的檢測。IHC常用的單克隆抗體主要是抗上皮來源的蛋白，如抗上皮細胞粘附分子（EpCAM）抗體Ber-Ep4、抗細胞角蛋白家族（CK）抗體AE1/AE3。IHC診斷NSCLC微轉(zhuǎn)移具有較高的敏感性，可達10-5-10-6，而且檢測方法簡便；缺點是由于酶染色和非特異性抗原的表達而導致特異性較低。

2.2 聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）PCR是體外酶促合成、擴增特異基因片段的一種方法，它能使目標DNA片段呈指數(shù)擴增。目前在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移檢測中應(yīng)用較多的是逆轉(zhuǎn)錄PCR，它是以腫瘤組織特異性表達的mRNA為分子標記，先合成cDNA后再進行PCR擴增，通過檢測腫瘤標志物mRNA來反應(yīng)腫瘤細胞的存在。熒光實時定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR）是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR過程，通過加入已知濃度的標準樣品繪制的標準曲線，能推算出樣品中初始模板的濃度，可定性、定量的檢測微量腫瘤細胞。熒光實時定量PCR是目前最敏感的檢測方法[5]，敏感性可達10-7，與逆轉(zhuǎn)錄PCR相比，它可以用正常組織作對照來設(shè)定合理的cut-off值，在一定程度上減少了假陽性率。PCR主要用于檢測NSCLC淋巴結(jié)、骨髓及外周血中的微轉(zhuǎn)移灶，常用的分子標志物有細胞角蛋白家族（CKs）、黏蛋白-1（mucin1, MUC1）、LUNX（lung-specific x gene）、CEA、p53、Kras、端粒酶逆轉(zhuǎn)酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）和肺泡表面蛋白。

2.3 流式細胞術(shù)（flow cytometry, FCM） 流式細胞術(shù)也稱熒光激活細胞分離術(shù)，采用熒光標記相應(yīng)抗體來檢測骨髓和外周血中的腫瘤細胞。其優(yōu)點是操作簡單、快速、數(shù)據(jù)精確。缺點是FCM不能提供細胞形態(tài)方面的信息，無法區(qū)分帶有同樣標志物的腫瘤細胞和正常細胞。FCM常用于骨髓及外周血中腫瘤細胞的檢測。FCM檢測靶細胞的敏感度僅為10-5，在使用時很大程度上依賴于可分析的細胞數(shù)目，因此極大地限制了其廣泛應(yīng)用。

2.4 CellSearch系統(tǒng) CellSearch系統(tǒng)集免疫磁珠富集技術(shù)和免疫熒光技術(shù)于一體，先將細胞富集后再進行自動化檢測，其生物學原理是依據(jù)腫瘤細胞與正常細胞表達的表面蛋白不同將二者區(qū)分開來。來源于中胚層的白細胞表達CD45，來源于外胚層的癌細胞表達上皮細胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM）和細胞角蛋白（cytokeratin, CK），但不表達CD45。該系統(tǒng)首先利用免疫磁珠技術(shù)將EpCAM標記的CTCs從血液樣本中富集出來，然后加入熒光抗體標記和化學染色來準確識別CTCs，系統(tǒng)將“EpCAM+CK+DAPI+CD45-”的細胞界定為CTCs。CellSearch系統(tǒng)可以檢測7.5 mL血液樣品（約含400多億的血細胞）中單一的CTCs，是目前自動化程度最高的CTCs檢測技術(shù)，且受人為因素影響較小，具有較高的特異性、敏感性及可重復性[6]，該系統(tǒng)是目前唯一被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌 CTCs檢測的新技術(shù)[7-9]。近年來，應(yīng)用該系統(tǒng)檢測肺癌及其他實體瘤CTCs的研究也越來越受重視。但該檢測系統(tǒng)會遺漏缺失上皮細胞表面標志的腫瘤細胞，例如經(jīng)過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）后的細胞，而且檢測費用較高，限制了其在臨床上廣泛應(yīng)用。

2.5 其他方法 蛋白免疫印跡（Western blot or Immunoblotting），是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)，具有分辨率高、特異性強和敏感度高等優(yōu)點。目前該方法在微轉(zhuǎn)移檢測上應(yīng)用較少，Chen等[10]曾報道使用Western blot檢測NSCLC淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移。此外，也有研究應(yīng)用基因表達譜技術(shù)[11]和蛋白質(zhì)組學技術(shù)[12]檢測NSCLC淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移。

3 微轉(zhuǎn)移與NSCLC預后

3.1 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與NSCLC預后 淋巴結(jié)是否受累是包括NSCLC在內(nèi)的多數(shù)實體瘤術(shù)后無瘤生存期（disease free survival, DFS）和總生存期（overall survival, OS）的重要預測因子。應(yīng)用IHC或逆轉(zhuǎn)錄PCR對常規(guī)病理方法檢查陰性的淋巴結(jié)進行微轉(zhuǎn)移檢測，有助于對患者進行更準確的“分子分期”，在預測復發(fā)和評估預后上均有著重要意義，同時能夠為制定多學科綜合治療方案提供更準確的依據(jù)。周清華等[13]的研究通過對比常規(guī)病理組織學方法和逆轉(zhuǎn)錄PCR診斷肺癌微轉(zhuǎn)移，證實逆轉(zhuǎn)錄PCR敏感性更強，靈敏度更高，能提高淋巴結(jié)和循環(huán)系統(tǒng)微轉(zhuǎn)移的檢出率。楊浩賢等[14]用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測淋巴結(jié)中LUNX mRNA的表達，也證實NSCLC患者的縱隔淋巴結(jié)中，有常規(guī)病理學無法診斷的微轉(zhuǎn)移灶存在。

Kubuschok等[15]報道，用IHC檢測127例患者的淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，檢出25例患者存在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，隨訪64個月，發(fā)現(xiàn)檢測出微轉(zhuǎn)移的患者其腫瘤復發(fā)率較無微轉(zhuǎn)移者高出2.7倍，OS風險比HR=2.5。Le Pimpec-Barthes等[16]用逆轉(zhuǎn)錄PCR的檢測淋巴結(jié)中CK19 mRNA。在未發(fā)生微轉(zhuǎn)移的患者，術(shù)后2年生存率為100%，而伴有微轉(zhuǎn)移的患者，2年生存率僅為64.5%，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.04）。歐陽偉煒等[17]應(yīng)用IHC檢測78例I期NSCLC根治術(shù)后區(qū)域淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移，并評估淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與患者長期生存的關(guān)系。淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移檢出率為26.9%（21/78），伴有微轉(zhuǎn)移的患者中位生存期為23個月，不伴有微轉(zhuǎn)移的患者為87個月，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.008）。

迄今，檢測淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移最大樣本量的前瞻性臨床試驗ACOSOG Z0040[18]的研究結(jié)果再次證實了淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的預后價值。經(jīng)HE染色確認為N0的NSCLC患者中，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移組與未發(fā)生微轉(zhuǎn)移組相比，術(shù)后DFS（HR=1.63, P=0.009）和OS（HR=1.59, P=0.007）均有統(tǒng)計學差異。然而發(fā)生微轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)數(shù)目及淋巴結(jié)站與患者OS無相關(guān)性。多變量分析顯示，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移是預后的獨立危險因素。

綜合分析（表1），雖然有少數(shù)研究[19-21]未證實淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與不良預后有明確關(guān)系，但大量研究表明淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移是NSCLC患者預后的獨立危險因素。在今后的臨床實踐中，我們可以考慮通過檢測淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，對患者進行危險因素分層，復發(fā)風險高的患者可進行術(shù)后的輔助治療[22]。

3.2 骨髓微轉(zhuǎn)移與NSCLC預后 骨髓組織內(nèi)存在大量網(wǎng)狀結(jié)締組織，可以對血流中的癌細胞起過濾作用，釋放入血的癌細胞經(jīng)過骨髓即被濾下，理論上骨髓中的彌散腫瘤細胞（disseminated tumour cells，DTCs）是比較理想的微轉(zhuǎn)移檢測指標。

表1 探討淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移預后作用的主要臨床研究Tab 1 Major clinical studies of the prognostic value of lymph node micrometastasis

目前，骨髓微轉(zhuǎn)移檢測的取材部位主要是肋骨和髂骨，有研究比較了兩個部位微轉(zhuǎn)移的檢出率，證實肋骨的檢出率更高[23,24]。骨髓微轉(zhuǎn)移的發(fā)生率與NSCLC的TNM分期無關(guān)[24-26]。

關(guān)于骨髓微轉(zhuǎn)移的預后價值，各研究結(jié)果互為矛盾（表2），究其原因在于研究方法的不統(tǒng)一和研究例數(shù)不足，且大部分研究未設(shè)計正常對照組。ACOSOG Z0040[18]研究顯示，骨髓微轉(zhuǎn)移發(fā)生與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移無關(guān)，患者的預后與骨髓微轉(zhuǎn)移發(fā)生無相關(guān)性。至此，我們不禁產(chǎn)生一個疑問：骨髓腔中的DTCs是真的轉(zhuǎn)移灶，還是僅僅是我們看到的一個表象呢？很多假設(shè)試圖解釋這一現(xiàn)象，Osaki等[27]檢測了同一批患者的淋巴結(jié)和骨髓微轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)這兩個部位微轉(zhuǎn)移之間沒有相關(guān)性，這可能與不同部位微轉(zhuǎn)移的發(fā)生的機制不同有關(guān)；也有觀點認為，骨髓腔的DTCs大部分處于休眠期，這些休眠細胞要活化并形成顯性轉(zhuǎn)移灶，需要轉(zhuǎn)移部位微環(huán)境、DTCs自身突變和患者遺傳特性三者的綜合作用[28]。目前，骨髓微轉(zhuǎn)移的預后價值尚無定論。

3.3 胸膜腔微轉(zhuǎn)移與NSCLC預后 胸膜腔微轉(zhuǎn)移可能是造成 NSCLC患者術(shù)后并發(fā)惡性胸腔積液及腫瘤復發(fā)的直接原因。通過胸腔灌洗液細胞學（pleural lavage cytology,PLC）檢查來評價胸膜腔微轉(zhuǎn)移的研究已經(jīng)進行了半個世紀[29-31]，但大多數(shù)研究樣本量小，預后價值尚不明確。

為了明確胸膜腔微轉(zhuǎn)移的預后價值，國際胸腔灌洗液細胞學研究者聯(lián)盟初篩了目前已經(jīng)發(fā)表研究結(jié)果31篇相關(guān)論文，最終共有8,736例患者被納入meta分析，511（5.8%）例患者PLC陽性。與PLC陰性患者相比，PLC陽性者預后更差，風險比HR=1.465（95%CI: 1.290-1.665;P＜0.001）。PLC陽性是預后的獨立危險因素[32]。Srdjan Saso等[33]認為術(shù)前PLC陽性是患者術(shù)后發(fā)生胸膜、遠處及全身復發(fā)的預測因子，同時PLC陽性預示著NSCLC患者尤其是I期NSCLC患者預后更差。基于以上假設(shè)，他們篩選了2011年以前收錄在Medline、EMBASE和Google Scholar三個數(shù)據(jù)庫的相關(guān)研究，最終共4,450例患者被納入分析。結(jié)果顯示，術(shù)前PLC陽性患者與陰性患者相比，胸膜、遠處及全身復發(fā)的風險更高（OR=4.82, 95%CI: 2.45-9.51），隨訪顯示，PLC陽性組與陰性組相比，OS風險比HR=2.08（95%CI:1.71-2.52, P＜0.000,01）。單獨分析9項研究中的I期患者，OS風險比HR=4.2（95%CI: 2.65-6.65, P＜0.02）。

然而，ACOSOG Z0040[18]的研究結(jié)果卻未能證實以上結(jié)論，術(shù)前和術(shù)后PLC陽性率分別為3.3%（29/885）和2.0%（17/871），PLC性質(zhì)與患者OS無相關(guān)性。

如何解釋這一爭議？研究結(jié)果的矛盾性一方面與納入meta分析的各個研究并沒有采用標準的灌洗方法且大多數(shù)研究的隨訪時間都少于3年有關(guān)；另一方面可能與ACOSOG Z0040 PLC陽性檢出率過低，使得陽性組和陰性組的可比性差有關(guān)。

表2 探討骨髓微轉(zhuǎn)移預后作用的主要臨床研究Tab 2 Major clinical studies of the prognostic value of DTC in bone marrow

3.4 外周血微轉(zhuǎn)移與NSCLC預后 腫瘤細胞脫落、侵襲并進入血液循環(huán)是實現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的最初階段。楊浩賢等[34]用逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測肺癌患者和肺良性疾病患者外周血中的LUNX mRNA，肺良性病變患者外周血中未見LUNX-mRNA表達，4例術(shù)前和術(shù)中LUNX mRNA表達陽性的患者，術(shù)后1周轉(zhuǎn)為陰性，提示外周血中LUNX mRNA來源于肺的原發(fā)腫瘤細胞。周清華等[35]用逆轉(zhuǎn)錄PCR，檢測患者外周血中CK19 mRNA表達，提示外周血“微轉(zhuǎn)移”是預測局部晚期NSCLC預后的獨立因素。

近年來，許多研究通過計算外周血中CTCs數(shù)目來檢測外周血微轉(zhuǎn)移。在肺癌患者中，CTCs數(shù)量與腫瘤進展呈正相關(guān)，尤其伴隨腫瘤遠處轉(zhuǎn)移灶的增多而升高。檢測腫瘤患者外周血CTCs可早期評估腫瘤轉(zhuǎn)移風險，預測腫瘤復發(fā)和判斷患者預后。

Hofman等[36]檢測了208例可手術(shù)NSCLC患者和39例健康對照者的外周血。他們采用ISET法檢測外周血中非血細胞的循環(huán)細胞（circulating nonhematologic cells,CNHCs)。受試者平均隨訪24個月。上述患者中，CNHCs平均個數(shù)是40。CNHCs≥50和＜50的患者相比，OS和DFS均更短，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002和P=0.001）。單因素和多因素分析均顯示，排除疾病分期的影響，術(shù)前CNHCs數(shù)目≥50預示著更短的DFS和OS。Krebs等[37]通過CellSearch系統(tǒng)檢測101例局部晚期和晚期NSCLC患者外周血CTCs。IV期患者外周血中CTCs數(shù)目（0-146）明顯高于IIIb期（0-3）和IIIa期（未檢測到）。單因素分析顯示，化療前每7.5 mL外周血中CTCs＜5個和≥5個的患者的PFS分別是6.8個月和2.4個月（P＜0.001），OS分別是8.1個月和4.3個月（P＜0.001），差異有統(tǒng)計學意義。多因素分析顯示，CTCs數(shù)量是OS的最強預測因子。

4 微轉(zhuǎn)移檢測的臨床意義及研究展望

對NSCLC患者的微轉(zhuǎn)移灶進行檢測，一方面支持NSCLC早期的全身隱匿性播散，提示NSCLC是一種全身性疾病而非局灶性病變；另一方面，可以補充常規(guī)病理學確認的TNM分期，為更準確的“分子分期”提供依據(jù)，從而指導治療方案的選擇。目前NSCLC微轉(zhuǎn)移的研究中，還存在幾個問題：①尚缺乏特異性強、靈敏度高的理想檢測標志物；②對特定的檢測部位最優(yōu)的檢測方法不統(tǒng)一，假陽性和假陰性等問題影響了研究結(jié)論；③骨髓腔中DTCs和外周血CTCs的最佳檢測時間尚不明確；④檢測出有微轉(zhuǎn)移的患者應(yīng)采取何種治療措施沒有循證醫(yī)學證據(jù)。同時，微轉(zhuǎn)移對NSCLC的預后價值還存在爭議，微轉(zhuǎn)移的檢出并不代表一定會形成顯性轉(zhuǎn)移灶，腫瘤細胞自身生物學特性、機體免疫狀況和局部微循環(huán)等都是重要的影響因素。因此，篩選敏感性和特異性均較高的分子標志物是今后研究的一個方向。同時為得到更為可靠的研究結(jié)論, 減少假陽性結(jié)果，獲取恰當?shù)慕M織標本、選擇合適的檢測方法、建立詳盡的檢測過程及制定規(guī)范的質(zhì)控標準極為重要。未來我們期待多中心合作，開展前瞻性的臨床研究，采用統(tǒng)一規(guī)范的標準對肺癌微轉(zhuǎn)移灶進行檢測，明確微轉(zhuǎn)移對NSCLC的預后價值。同時，對伴有微轉(zhuǎn)移的NSCLC患者予以恰當?shù)妮o助治療，試圖消除微小殘留病灶，獲得生存獲益。