張慧卿 方 念 蘆 珊 何 波 萬(wàn)以葉

氯喹促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡及其機(jī)制*

張慧卿①方 念②蘆 珊①何 波①萬(wàn)以葉①

目的：研究自噬對(duì)順鉑（cisplatin，DDP）誘導(dǎo)的胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡的影響，并初步探討其可能機(jī)制。方法：DDP和（或）氯喹處理胃癌SGC7901細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，MDC染色后熒光顯微鏡觀察自噬囊泡，Western Blot檢測(cè)自噬和凋亡相關(guān)蛋白。結(jié)果：5 mg/L的順鉑作用于胃癌SGC7901細(xì)胞24 h，細(xì)胞凋亡率為21.07%±2.12%，同時(shí)觀測(cè)到自噬囊泡增多和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)升高；氯喹特異性抑制自噬活性后，提高了順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率（30.16%±3.54%，P＜0.05）；檢測(cè)到凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和P53表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)下降。結(jié)論：自噬在順鉑誘導(dǎo)胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起保護(hù)作用，氯喹抑制自噬后，可能通過(guò)激活P53蛋白及滅活Bcl-2蛋白的表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，聯(lián)合應(yīng)用順鉑和氯喹有望成為胃癌治療的新策略。

自噬 順鉑 氯喹 凋亡 胃癌

化療是治療胃癌的主要方法之一。順鉑作為傳統(tǒng)的化療藥，貫穿在胃癌化療的不同時(shí)段，如輔助化療的ECF方案，姑息化療的DCF方案和分子靶向治療的PF+曲妥珠單抗方案，在NCCN指南中都被作為Ⅰ類(lèi)證據(jù)推薦使用［1-3］。研究表明，方案含順鉑的晚期胃癌患者更能從化療中獲益，生存期更長(zhǎng)［4］。目前認(rèn)為，化療藥主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的殺傷作用。自噬是真核生物分割降解細(xì)胞內(nèi)蛋白、脂質(zhì)和細(xì)胞器的過(guò)程，維持著細(xì)胞代謝的平衡，在腫瘤的發(fā)展和治療中起重要作用［5-6］。新近報(bào)道，順鉑在誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的同時(shí)，也引起了自噬的發(fā)生，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞存活［7］。然而，順鉑是否誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生自噬，以及自噬對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在觀察順鉑作用于胃癌SGC7901細(xì)胞前后自噬的變化，以及聯(lián)合自噬抑制劑氯喹對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的影響，并初步探討其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌細(xì)胞株SGC7901購(gòu)自于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。用含10%胎牛血清、雙抗（100 U/mL青霉素及0.1 mg/mL鏈霉素）的DMEM完全培養(yǎng)基（Gibco公司），接種于37℃，5%CO2，飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞分組與藥物處理

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞共分為4組：對(duì)照組（control）、氯喹組（chloroquine，CQ）、順鉑組（cisplatin，DDP）和聯(lián)合組（CQ+DDP）（氯喹和順鉑均為美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品）。對(duì)照組藥物為零劑量，氯喹組只用20 μmol/L的氯喹；順鉑組加入5 mg/L DDP；聯(lián)合組先用20 μmol/L的氯喹處理細(xì)胞，1 h后加入5 mg/L的DDP。各組細(xì)胞于藥物處理后24 h進(jìn)行觀察和檢測(cè)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后加入既定濃度的DDP和（或）氯喹，每組設(shè)9個(gè)復(fù)孔，每孔終體積為200 μL，作用24 h后加入20 μL MTT溶液（3 g/L），將細(xì)胞移入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)6 h。吸去培養(yǎng)基，每孔內(nèi)加入150 μL DMSO，振蕩搖勻，用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光度值。

1.4 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，加入既定濃度的DDP和（或）氯喹。24 h后收集對(duì)照組和處理組細(xì)胞，用不含EDTA的胰蛋白酶消化、收集總細(xì)胞，PBS洗滌2次，棄上清。加入400 μL結(jié)合緩沖液使細(xì)胞重懸，再加6 μL AnnexinⅤ-FITC，4 μL PI，室溫避光孵育15 min。采用激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，分別以紅色和綠色熒光通道檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.5 MDC染色并熒光顯微鏡定性檢測(cè)自噬

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，待細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)密度達(dá)80%～90%時(shí)棄去培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)原培養(yǎng)液，PBS溶液洗滌。對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理，在5%CO2、37℃飽和濕度下培養(yǎng)24 h后，加入0.05 mmol/L的MDC溶液孵育60 min，PBS清洗4次，于倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察和攝片（激發(fā)波長(zhǎng)380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm）。

1.6 Western blot檢測(cè)自噬和凋亡相關(guān)蛋白

分別收集對(duì)照組和處理組細(xì)胞，加入120 μL RIPA裂解液，EP管收集后進(jìn)行超聲，超聲后14×103r/min離心30 min，取上清液，采用Bradford方法進(jìn)行蛋白定量。上樣前煮沸5 min，冰上冷卻后10×103r/min離心30 s，吸取上清進(jìn)行SDS-PAGE（200 V，45 min），100 V轉(zhuǎn)膜1 h，0.5%（W/V）脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，0.1%（V/V）TBST洗膜2次后，二抗室溫孵育1 h，洗膜3次后采用ECL法顯色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 順鉑和氯喹對(duì)SGC7901細(xì)胞活力的影響

藥物作用24 h后（即實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至48 h），氯喹組細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)變化，DDP組和聯(lián)合組觀察到明顯的細(xì)胞皺縮，脫離貼壁等現(xiàn)象。藥物處理前，各組細(xì)胞增殖速率無(wú)明顯差異（P＞0.05），藥物處理24 h后（實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至48 h），氯喹組與對(duì)照組仍無(wú)顯著性差異，但DDP組和聯(lián)合組細(xì)胞增殖下降，顯著低于對(duì)照組，而且聯(lián)合組明顯低于順鉑單藥組（圖1）。

圖1 藥物處理后胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖活力Figure 1 Effects of DDP and chloroquine on cell viability of SGC7901 cells

2.2 順鉑誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞發(fā)生自噬

細(xì)胞自噬被激活的典型形態(tài)學(xué)特征之一是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量的酸性自噬囊泡（autophagic vacuole），而單丹磺酰戊二胺（monodansylcadaverin，MDC）可被細(xì)胞吸收并選擇性聚集于自噬囊泡中。本研究在MDC染色后，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察到，藥物處理24h時(shí)，與對(duì)照組（圖2A）比較，DDP組（圖2B）的自噬囊泡顯著增多，聯(lián)合自噬抑制劑氯喹后（圖2C），自噬囊泡明顯減少（核周的點(diǎn)狀熒光結(jié)構(gòu)即為自噬囊泡）。Western blot的結(jié)果顯示，與對(duì)照組（圖3A）相比，氯喹組（圖3B）自噬蛋白的表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)濃度的DDP（圖3C）作用于SGC7901細(xì)胞24 h時(shí)，Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)升高，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值顯著增加（P＜0.01），聯(lián)用氯喹后（圖3D），LC3-Ⅱ/Ⅰ比值出現(xiàn)下降（P＜0.01，圖3）。

2.3 氯喹促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡

藥物作用于胃癌SGC7901細(xì)胞24h后，與對(duì)照組相比，氯喹組細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯差異（1.53%±0.95%vs.1.67%±0.88%，P＞0.05）；DDP組（圖4A）和聯(lián)合組（圖4B）的凋亡率均有升高，并且聯(lián)合組的凋亡率（30.16%±3.54%）顯著高于DDP組（21.07%±2.12%）（P＜0.05，圖4）。

圖2 熒光顯微鏡觀察胃癌SGC7901細(xì)胞自噬囊泡（×400）Figure 2 Autophagy vesica observed by fluorescence microscopy（MDC staining，×400）

圖3 Western blot檢測(cè)SGC7901細(xì)胞自噬蛋白的表達(dá)Figure 3 Expression of proteins in SGC7901 cells by Western blot

圖4 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測(cè)SGC7901細(xì)胞凋亡Figure 4 Apoptotic rate of SGC7901 cells detected by Annexin V-FITC/PI double-staining

2.4 氯喹影響順鉑誘導(dǎo)的SGC7901細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

藥物處理24 h后，與對(duì)照組相比，氯喹組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與順鉑組比較，聯(lián)合組Caspase-3和P53蛋白的表達(dá)升高，Bcl-2蛋白的表達(dá)減少，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但P62蛋白水平未見(jiàn)明顯改變（P＞0.05）。

3 討論

近年來(lái)，世界大部地區(qū)胃癌發(fā)病率呈下降趨勢(shì)，但權(quán)威數(shù)據(jù)表明，2008年全球仍有738 000例患者死于胃癌，在腫瘤相關(guān)性死亡中排第二位［8］?；熓侵委熚赴┑娜笫侄沃?，順鉑作為經(jīng)典有效的化療藥物，在胃癌術(shù)后輔助化療和姑息化療中均起著舉足輕重的作用［1-3］。遺憾的是，多數(shù)患者最終因耐藥而導(dǎo)致化療失敗，晚期胃癌的中位生存時(shí)間仍然徘徊在9.2～13.8個(gè)月［2-3］。研究表明，化療藥物和自噬調(diào)節(jié)劑的聯(lián)合可以改善腫瘤患者的預(yù)后，逆轉(zhuǎn)耐藥、細(xì)胞自噬已經(jīng)成為化療耐藥的研究熱點(diǎn)［9-10］。Sotelo等［11］開(kāi)展的Ⅱ期臨床隨機(jī)試驗(yàn)表明，與安慰劑相比，在傳統(tǒng)的化放療基礎(chǔ)上，給膠質(zhì)母細(xì)胞瘤術(shù)后患者每天口服氯喹150 mg，為期12個(gè)月，在一定程度上延長(zhǎng)了患者的中位生存期。

1962年Ashford通過(guò)電子顯微鏡觀察到了自噬現(xiàn)象，1963年，諾貝爾生理獎(jiǎng)獲得者Christian de Duve第一次提出了自噬的概念［12-13］。自噬（autophagy）又稱(chēng)為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，是真核細(xì)胞通過(guò)溶酶體降解其自身的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器，實(shí)行“自我消化”的一系列生化過(guò)程［14］。在這個(gè)過(guò)程中，首先是細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器被雙層膜包裹形成自噬泡，然后再與溶酶體融合形成自噬溶酶體，最終使被包裹的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器降解。自噬對(duì)腫瘤具有保護(hù)和殺傷的雙重作用，但在絕大多數(shù)情況下，自噬可能起著維持腫瘤細(xì)胞生存，逃避細(xì)胞凋亡的作用［15］。

目前，自噬的檢測(cè)方法主要有以下3種：電子顯微鏡下觀察自噬體形態(tài)結(jié)構(gòu)、自噬體標(biāo)記蛋白LC3的檢測(cè)和基于自噬性降解的“自噬潮”動(dòng)態(tài)分析［16］。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，Agt8/LC3）是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白。細(xì)胞內(nèi)存在兩種形式的LC3蛋白：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。LC3蛋白在合成后其C端即被Atg4蛋白酶切割變成LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ散在分布于細(xì)胞漿內(nèi)。當(dāng)自噬體形成后，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ并定位于自噬體內(nèi)膜和外膜。與其他一些定位于自噬性結(jié)構(gòu)膜上的Atg蛋白不同，與溶酶體融合前LC3-Ⅱ始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上，因此被用來(lái)作為自噬體的標(biāo)記，且LC3-Ⅱ的水平在某種程度上反映了自噬體的數(shù)量［17］。Ren等［7］報(bào)道，順鉑在誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的同時(shí)，也引起了自噬的發(fā)生，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞存活。順鉑是否能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生自噬，國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究表明5 mg/L的順鉑作用于胃癌SGC7901細(xì)胞24 h，觀察到細(xì)胞增殖活力下降，細(xì)胞凋亡增加，也發(fā)現(xiàn)自噬囊泡明顯增多，Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。這些結(jié)果一致證實(shí)，順鉑在誘導(dǎo)胃癌SGC7901細(xì)胞調(diào)亡的同時(shí)，也誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬的發(fā)生。

氯喹是一種自噬特異性抑制劑，具有弱化溶酶體內(nèi)酸性環(huán)境，穩(wěn)定溶酶體膜的功能，它能增強(qiáng)多種化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用［10，18］。在本實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組相比，氯喹組自噬囊泡明顯減少，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低，細(xì)胞的增殖和凋亡無(wú)明顯變化，提示20 μmol/L的氯喹抑制了胃癌SGC7901細(xì)胞的自噬活性，但氯喹本身不能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。單獨(dú)加入化療藥順鉑，誘發(fā)了胃癌SGC7901細(xì)胞自噬，在聯(lián)合氯喹后，自噬活性明顯下降，細(xì)胞凋亡顯著增加。這些結(jié)果說(shuō)明，順鉑引起的自噬是保護(hù)性自噬，部分拮抗了順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡，氯喹通過(guò)抑制自噬活性促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。這與Li等［19］有關(guān)3-MA和苦參堿作用于胃癌細(xì)胞的研究結(jié)果相類(lèi)似。本研究還發(fā)現(xiàn)，在順鉑聯(lián)合氯喹組，Caspase-3和P53蛋白的表達(dá)上調(diào)，而凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)下降，提示氯喹特異性抑制自噬后可能通過(guò)激活P53蛋白以及滅活Bcl-2蛋白來(lái)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞啟動(dòng)程序性的細(xì)胞死亡，引起Caspase蛋白依賴(lài)的細(xì)胞凋亡，從而增加順鉑對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞的化療敏感性。

總之，順鉑作為胃癌化療的常用藥物，在誘導(dǎo)胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡的同時(shí)，也誘發(fā)了保護(hù)性自噬，加入自噬抑制劑氯喹能增強(qiáng)順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷作用，提高化療敏感性。因此，氯喹和化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用有望成為胃癌治療的新策略，值得更進(jìn)一步研究其體內(nèi)作用和臨床療效。

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（2013-03-29收稿）

（2013-06-01修回）

Chloroquine promotes DDP-induced apoptosis in human gastric cancer cell line SGC7901

Huiqing ZHANG1,Nian FANG2,Shan LU1,Bo HE1,Yiye WAN1

Huiqing ZHANG;E-mail:hqzhang888@sina.com
1The Third Department of Medical Oncology,Jiangxi Provincial Tumor Hospital,Nanchang 330029,China
2Gastrointestinal Department of Internal Medicine,The FourthAffiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang,330006,China

Objective:To investigate the mechanism and effects of autophagy on cisplatin(DDP)-induced apoptosis in human gastric cancer cell line SGC7901.Methods:Cell proliferation was determined by an MTT assay after the SGC7901 cells were treated with DDP and/or chloroquine.Cell apoptosis was determined by flow cytometry.Autophagy and related protein expressions were detected by Western blot.Autophagy was quantitatively analyzed by fluorescence microscopy after monodansylcadaverine staining was performed.Results:The cells were treated with 5 mg/L of DDP for 24 h,the rate of cell apoptosis was(21.07±2.12)%.Autophagy,characterized by an increase in the number of autophagic vesicles and LC3-II protein level,was observed in DDP-treated cells.After autophagy was inhibited by chloroquine,the rate of cell apoptosis was increased to(30.16±3.54)%.In addition,caspase-3 and P53 protein levels were increased,but Bcl-2 protein was decreased.Conclusion:Autophagy protected human gastric cancer cell line SGC7901 from DDP-induced apoptosis.In addition,the inhibition of autophagy could promote apoptosis.The combined therapy of DDP and chloroquine may be a promising therapeutic strategy for gastric cancer.

autophagy,cisplatin,chloroquine,apoptosis,gastric cancer

10.3969/j.issn.1000-8179.20130507

①江西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)三科(南昌市330029);②南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

*本文課題受江西省青年自然基金項(xiàng)目（編號(hào)：20122BAB215029）資助

張慧卿 hqzhang888@sina.com

This study was supported by the Jiangxi Province Youth Science Foundation(No.20122BAB215029)

（本文編輯：周曉穎）