劉詩音 王 莘 (吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，吉林 長春 130118)

血栓形成傾向與血液中凝血質(zhì)的含量相關(guān)，臨床研究亦發(fā)現(xiàn)，老年血栓病患者血漿凝血質(zhì)濃度明顯增高，且抗原水平和活性明顯高于正常人〔1〕，血液中凝血質(zhì)含量是動脈血栓形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔2〕。在血液中加入凝血質(zhì)，通過計算凝血時間診斷血栓形成，方法簡單。目前只有在單核細(xì)胞中細(xì)菌脂多糖類人工誘導(dǎo)合成凝血質(zhì)。本文利用白地霉發(fā)酵提取純化凝血質(zhì)，對預(yù)防、診斷血栓疾病提供了新的藥物來源途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 白地霉:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室提供。SD大鼠:體重250～280 g，30只，雌雄各半。由長春市生物制品研究所提供。

1.2 試劑 D-半乳糖，F(xiàn)eCl3，Sephadex G-200。

1.3 方法

1.3.1 白地霉發(fā)酵提取純化凝血質(zhì) PDA培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵，收集菌絲體，凍干，－4℃冰箱中保藏。白地霉菌絲體(乙醇浸提，先38℃ ～50℃，后30℃以下)，提取液濃縮 (硫酸鈉脫水)，膏狀物 (乙醚提取)，乙醚濾液 (濃縮)，濃縮液 (丙酮沉淀)，沉淀物 (凝血質(zhì)粗制品)Sephadex G-200純化得凝血質(zhì)純品。

1.3.2 動物實(shí)驗(yàn) 將20只 SD大鼠，每天予 D-半乳糖0.125 g/kg皮下注射共40 d構(gòu)建大鼠衰老模型。之后分成年老空白組及年老血栓誘導(dǎo)組，每組雌雄各5只。血栓誘導(dǎo)組用5%FeCl3溶液誘導(dǎo)血栓生成。24 h后，將30只大鼠分為青壯組，年老組及年老血栓誘導(dǎo)組分別用斷尾取血方法取血一大滴滴到載玻片上，迅速滴加5 μl、0.1 g/ml濃度凝血質(zhì)溶液，傾斜載玻片計時。用針尖每5 s劃一次血液，當(dāng)出現(xiàn)絲狀物，計時停止，對比各組凝血時間。

2 結(jié)果

2.1 凝血質(zhì)純化 白地霉發(fā)酵提取的粗蛋白經(jīng)純化后，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，純化蛋白質(zhì)與marker在同一條帶上，分子量為47 kD左右。見圖1。

圖1 凝血質(zhì)純化蛋白SDS-PAGE電泳圖

2.2 各組體外凝血時間 青壯組最高凝血時間為41 s，最低凝血時間為37s，平均凝血時間為39 s。老年組最高凝血時間為39 s，最低凝血時間為29 s，平均凝血時間為34 s;其中4只大鼠凝血時間與其他大鼠凝血時間有較大差距，分別為29、30、30、29 s，平均凝血時間為29 s、年老誘導(dǎo)血栓組最高凝血時間為27 s，最低凝血時間為24 s，平均凝血時間為25 s。

2.3 觀察大鼠體內(nèi)血栓的形成 青壯組經(jīng)觀察1個月，體內(nèi)均未出現(xiàn)血栓;老年組，凝血時間較低的4只大鼠3 d后體內(nèi)出現(xiàn)血栓;年老誘導(dǎo)血栓組24 h內(nèi)10只大鼠均因血栓死亡。

3 討論

凝血質(zhì)為胞內(nèi)蛋白，在提取純化過程中，要保證其酶活性，嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度。因?yàn)殡s蛋白較多，在提取純化過程中，需要較高的條件。

研究衰老機(jī)制、老年病需要可靠的衰老模型。復(fù)制衰老模型的依據(jù)是目前公認(rèn)的幾種衰老學(xué)說。D-半乳糖致衰老模型是我國學(xué)者基于衰老的代謝學(xué)說而復(fù)制的衰老模型，該模型系在一定的時間內(nèi)給動物連續(xù)注射D-半乳糖，使其細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度增高，在醛糖還原酶催化下，還原成半乳糖醇，后者不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響正常滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，功能障礙，代謝紊亂，最終機(jī)體衰老〔3〕。

動物血栓模型的制作基本遵循Virchow提出的血栓形成的經(jīng)典原理。對血液進(jìn)行體外凝血實(shí)驗(yàn)，檢測凝血時間，可根據(jù)凝血時間診斷是否會有血栓生成，為今后預(yù)防、診斷血栓疾病提供了新的藥物來源途徑。

1 Banai S，Gertz SD.Tissue factor as therapeutic target in coronary syndromes〔J〕.Am J Cardiol，2001;87:763-5.

2 Moreno PR，Palacios IF，Leon MN，et al.Histopathologic comparison of human coronary in-stent and post-balloon angioplasty restenotic tissue〔J〕.Am J Cardiol，1999;84:462-6.

3 Song X，Bao M，Li D.Advanced glycation in D-galactose induced mouseaging model〔J〕.Mech Ageing Dev，1999;108(3):239-51.