榮 揚(yáng)，趙強(qiáng)元， 劉 敏，齊永志， 王珍光，李 娜

(海軍總醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100048)

縱觀標(biāo)記免疫分析的發(fā)展史，近年來，化學(xué)發(fā)光免疫分析已占據(jù)了免疫分析的主導(dǎo)地位，尤其是進(jìn)口的化學(xué)發(fā)光試劑占據(jù)了相當(dāng)?shù)姆蓊~。光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)(light initiated chemiluminescence assay，LiCA)[1]作為一種新型的國(guó)產(chǎn)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，與進(jìn)口的酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在定量檢測(cè)結(jié)果上是否具有可比性，是目前需要探究的問題。

甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)[2]是臨床常用腫瘤標(biāo)志物。AFP由Abelev等于1963年發(fā)現(xiàn)，是一種胚胎蛋白[3-4]，在肝癌、胚胎細(xì)胞腫瘤、卵巢癌或睪丸癌患者血清中會(huì)明顯升高。CEA于1965年由Gold和Freedmen從結(jié)腸癌患者血清中發(fā)現(xiàn)，在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[5]中起重要作用;在非小細(xì)胞肺癌[6]、結(jié)腸癌、直腸癌及內(nèi)胚層來源的其他腫瘤癌變時(shí)會(huì)明顯升高。

我們?cè)u(píng)價(jià)了LiCA AFP、CEA定量檢測(cè)的分析性能，并與酶促化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑作了比較，以探討前者的方法優(yōu)勢(shì)和臨床適用性。

材料和方法

一、材料

1.儀器與試劑 LiCA HT和SP化學(xué)發(fā)光免疫分析儀[博陽(yáng)生物科技(上海)有限公司]及配套試劑(AFP、CEA試劑批號(hào)分別為 A1010、A1016)。BECKMAN-COULTER DXi800化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(酶促化學(xué)發(fā)光法，美國(guó) Beckman-Coulter公司)及配套試劑(AFP和CEA試劑批號(hào)分別為16688、195018)。

2.樣本 取自中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院臨床血清樣本，其中用于 AFP測(cè)定406例，用于CEA測(cè)定442例。

二、方法

1.分析靈敏度 評(píng)價(jià)方法參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)EP17-A[6]文件。在質(zhì)控在控的情況下，同批LiCA AFP/CEA試劑一次運(yùn)行零值校準(zhǔn)品20次，計(jì)算均值()及標(biāo)準(zhǔn)差(s)，以空白+2s來計(jì)算方法的分析靈敏度。

2.批內(nèi)精密度 參考 NCCLS EP5-A2[7]文件程序。采用同一批試劑、校準(zhǔn)品以各自配套的2個(gè)水平質(zhì)控血清作為測(cè)試標(biāo)本，一次運(yùn)行對(duì)標(biāo)本重復(fù)測(cè)定20次，計(jì)算、s及變異系數(shù)(CV)，此為批內(nèi)不精密度。相同質(zhì)控品檢測(cè)20 d，計(jì)算、s及CV，此為批間精密度。免疫定量精密度要求范圍批內(nèi)CV≤10%，批間CV≤15%。

3.線性 參考 NCCLS EP6-A[8]文件，選用已知高、低濃度2個(gè)樣本等比例稀釋成6個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度測(cè)定6次，剔出離群點(diǎn)，計(jì)算。以測(cè)定值為X軸、理論值為Y軸作圖，進(jìn)行線性回歸。斜率(b)在0.97～1.02時(shí)為可用線性范圍，否則縮小線性范圍直至b符合要求。

4.相關(guān)性分析 在質(zhì)控在控的情況下，分別采用LiCA和酶促化學(xué)發(fā)光法同時(shí)檢測(cè)AFP和CEA并做相關(guān)分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11.5軟件對(duì)2種系統(tǒng)的AFP、CEA定量相關(guān)系數(shù)(r)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

結(jié) 果

一、分析靈敏度

依據(jù)零值校準(zhǔn)品測(cè)定值計(jì)算所得，LiCA AFP和CEA 的分析靈敏度分別為0.112、0.05 ng/mL。

二、精密度

見表1。

表1 LiCA檢測(cè)AFP和CEA的精密度 (%)

三、線性

LiCA測(cè)定AFP和CEA的線性數(shù)據(jù)見表2。對(duì)表2數(shù)據(jù)做回歸分析，得出方程:YAFP=0.99 XAFP+1.36，r=0.999;YCEA=0.98XCEA+2.87，r=0.999。AFP 線性范圍為2.6 ～950.2 ng/mL，CEA線性范圍為1.2 ～862.6 ng/mL。

表2 LiCA測(cè)定AFP和CEA的線性數(shù)據(jù) (ng/mL)

四、相關(guān)性分析

以酶促化學(xué)發(fā)光法結(jié)果為基準(zhǔn)，對(duì)406例AFP血清樣本及442例CEA血清樣本分別做定量相關(guān)分析，相關(guān)方程分別為YAFP=1.027XAFP－0.516，r=0.997;YCEA=0.821XCEA+1.355，r=0.991，見圖 1、2。

圖1 LiCA和酶促化學(xué)發(fā)光法AFP定量結(jié)果相關(guān)性

圖2 LiCA和酶促化學(xué)發(fā)光法CEA定量結(jié)果相關(guān)性

討 論

1959年美國(guó)學(xué)者Berson和Yalow用放射免疫法成功測(cè)定了血漿胰島素[10]，開創(chuàng)了標(biāo)記免疫分析的新紀(jì)元。接著，各種新型的標(biāo)記物的不斷推出，使得標(biāo)記免疫分析有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展:從放射免疫發(fā)展到無放射性污染的酶聯(lián)免疫，再到靈敏度更高的熒光免疫，最后到易于自動(dòng)化的發(fā)光免疫?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是上世紀(jì)90年代出現(xiàn)的標(biāo)記免疫分析，根據(jù)其標(biāo)記物的不同又分為直接化學(xué)發(fā)光、酶促化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光和光激化學(xué)發(fā)光。

酶促化學(xué)發(fā)光[11]主要包括堿性磷酸酶(AP)系統(tǒng)、辣根過氧化物酶(HRP)系統(tǒng)等。美國(guó)Beckman-Coulter公司是AP系統(tǒng)的代表，其原理是采用磁性微粒為固相載體包被抗原或抗體，AP標(biāo)記抗原或抗體，利用免疫反應(yīng)使得AP同待測(cè)物結(jié)合到固相載體上，通過磁場(chǎng)分離、洗滌后加入底物金剛烷二氧環(huán)已烷(AMPPD)，數(shù)分鐘后測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度來測(cè)定待測(cè)物的濃度。

光激化學(xué)發(fā)光作為一種新的化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，是繼單線態(tài)氧分子能量傳遞發(fā)光免疫分析 技 術(shù)[12](luminescent oxygen channeling immunoassay，LOCI)技術(shù)問世之后，在國(guó)內(nèi)建立、發(fā)展并應(yīng)用于臨床檢測(cè)的一種新型檢測(cè)技術(shù)。其檢測(cè)原理是以填充了感光和發(fā)光染料的2種200 nm的高分子納米微球?yàn)檩d體分別共價(jià)交聯(lián)抗原抗體，由免疫反應(yīng)拉近感光和發(fā)光微球的距離至200 nm以內(nèi)。當(dāng)用680 nm激發(fā)光照射，感光染料被激活并釋放高能態(tài)的單線態(tài)氧給發(fā)光染料，4 μs后發(fā)光微粒發(fā)出610 nm的光，根據(jù)光信號(hào)得到待檢物的濃度，簡(jiǎn)而言之就是“結(jié)合則發(fā)光”。該方法屬于均相免疫反應(yīng)，相對(duì)于非均相免疫分析其實(shí)施難度更大，技術(shù)含量更高。

均相免疫反應(yīng)是在抗原抗體反應(yīng)過程中不需要清洗分離而在反應(yīng)結(jié)束后直接測(cè)量信號(hào)的免疫分析方法。而在免疫分析中，清洗分離這一步驟所產(chǎn)生的誤差占免疫分析總誤差的70%～80%，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等進(jìn)行定量分析由于包被不均一性和清洗分離的不確定性，導(dǎo)致其不精密度和準(zhǔn)確性不夠理想。光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)因具有免清洗分離的特點(diǎn)，減少了清洗和分離所帶來的誤差，減少了反應(yīng)時(shí)間，并且易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和高通量檢測(cè)[13]。因此，可以說LiCA技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)發(fā)展進(jìn)程中一個(gè)新的生力軍。作為非均相免疫分析的代表之一，美國(guó)Beckman-Coulter公司的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光因其先進(jìn)的工藝使其分析過程的誤差降到了很低的水平。而光激化學(xué)發(fā)光利用其免清洗技術(shù)實(shí)現(xiàn)了分析性能的可靠。

本研究對(duì)LiCA AFP和CEA定量檢測(cè)試劑的臨床性能做了評(píng)估，結(jié)果顯示LiCA測(cè)定AFP和CEA在分析靈敏度、線性和精密度方面均可滿足臨床應(yīng)用;與酶促化學(xué)發(fā)光法結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，2種檢測(cè)系統(tǒng)高度相關(guān)(r＞0.99)。由此可見LiCA檢測(cè)AFP和CEA的分析性能可以滿足符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求;且具有均相免清洗、試劑成本較低等優(yōu)點(diǎn)，因此能夠應(yīng)用于臨床，滿足廣大臨床實(shí)驗(yàn)室和患者的需求。

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