李 光

南京醫(yī)科大學(xué)附屬老年醫(yī)院/江蘇省省級機關(guān)醫(yī)院檢驗科,江蘇南京 210024

尿微量清蛋白在臨床實驗室的檢測已廣泛普及,全自動化分析儀的使用極大地提高了工作效率和檢測結(jié)果的精密度。但在實際臨床工作中發(fā)現(xiàn),雅培全自動生化分析儀沒有尿微量清蛋白的原裝配套試劑,國內(nèi)大多數(shù)臨床實驗室在開展這個項目的時候,使用的都是國產(chǎn)試劑,而國產(chǎn)試劑生產(chǎn)廠家眾多,各廠家提供的試劑說明書在檢驗方法中對副波長的要求也不盡相同,甚至有說明書對副波長只字未提,有些雖然在說明書中有要求,但廠家試劑應(yīng)用工程師在儀器的參數(shù)設(shè)置中并未設(shè)置有副波長,本研究旨在通過根據(jù)ISO15189方法或性能驗證的要求[1],比較添加副波長前后,尿微量清蛋白精密度的變化[2],評估副波長對尿微量清蛋白重復(fù)性的影響,同時觀察不同濃度標(biāo)本精密度的變化。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源 收集2018年11月12-16日本院門診和住院患者尿液標(biāo)本4份,要求:微量清蛋白濃度分別為10、100、200、400 mg/L的尿液標(biāo)本各一份,確保每份標(biāo)本的總量足夠25次檢測,并對每份標(biāo)本進行分裝冷凍保存。

1.2儀器與試劑 雅培全自動生化分析儀C16000(尿微量蛋白波長參數(shù):主波長340 nm,副波長700 nm)。中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)的尿微量清蛋白檢測試劑盒(R1、R2試劑)及配套校準(zhǔn)品；朗道實驗診斷有限公司提供的尿微量清蛋白質(zhì)控品。

1.3精密度測定方法 按照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會 (CLSI)頒布的EP15-A2(醫(yī)學(xué)實驗室精密度和準(zhǔn)確度的驗證指南)中的精密度驗證程序[3],在添加副波長前后分別做如下操作:檢驗程序按照5×1×5的方案檢測標(biāo)本。即:每個濃度標(biāo)本檢測5 d,每天一個分析批,每個分析批重復(fù)檢測5次。在每個運行批內(nèi),運行標(biāo)本。同時檢測質(zhì)控標(biāo)本。如果質(zhì)控結(jié)果超出可接受范圍,那么拒絕這個運行批,丟棄該批次結(jié)果,糾正存在的問題,在下一個運行批中重新檢測質(zhì)控標(biāo)本。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 按照EP15-A2文件進行試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理,計算添加副波長前后批內(nèi)精密度和總精密度,并與廠商聲明的精密度性能指標(biāo)進行比較。如果≤對應(yīng)的允許不精密度,表示已驗證批內(nèi)精密度和總精密度的驗證目標(biāo)。反之,表示驗證目標(biāo)未得到臨床實驗室驗證,實驗室應(yīng)查找原因,或與試劑廠商聯(lián)系,并取得幫助。所有統(tǒng)計學(xué)處理在Excel2007軟件上進行。

2 結(jié) 果

2.1添加副波長前后精密度變化 在10、100、200、400 mg/L 4個濃度的檢測結(jié)果中,發(fā)現(xiàn)添加副波長前,各個濃度的批內(nèi)精密度和總精密度均高于廠商聲明的允許不精密度要求5%,見表1。添加副波長后,10、100 mg/L尿液標(biāo)本的批內(nèi)精密度和總精密度均高于廠商聲明的允許不精密度要求5%。同時，添加副波長后,200 mg/L的尿液標(biāo)本的批內(nèi)精密度仍不符合廠商聲明的允許不精密度要求5%,而200 mg/L的尿液標(biāo)本總精密度,以及400 mg/L尿液標(biāo)本的批內(nèi)精密度、總精密度均符合廠商聲明的允許不精密度要求5%,見表2。

表1 添加副波長前尿微量清蛋白精密度驗證報告

表2 添加副波長后尿微量清蛋白精密度驗證報告

圖1 添加副波長前反應(yīng)曲線

2.2添加副波長前后反應(yīng)曲線的變化 添加副波長之前,在加入試劑R1和標(biāo)本之后曲線有一明顯跳點,加入試劑R2之后同樣也存在一個明顯的跳點,見圖1。在添加副波長之后,這兩個跳點均消失,見圖2。

圖2 添加副波長后反應(yīng)曲線

3 討 論

本研究采用雙波長分光光度法[4],其理論基礎(chǔ)是差吸光度和等吸收波長,它采用測量波長和參比波長同時檢測某個標(biāo)本溶液,以提高檢測結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度[5]。使用副波長的目的是有效減少雜散光影響；消除噪聲干擾及降低標(biāo)本脂濁、黃疸和溶血等干擾[6-7]。全自動生化分析儀在整個反應(yīng)的全程監(jiān)控中,主副波長同時監(jiān)測,全過程每點主波長吸光度值都同時減去同點副波長吸光度值,結(jié)合凹面光柵進行后分光,分光后的各波長由8～16個固定監(jiān)測器同時接收,對其中兩個波長的信息用兩個前置放大器進行對數(shù)放大,進而求出其吸光度差。通過分析表1和表2可以看出尿微量清蛋白檢測同一濃度在添加副波長前后精密度有較大變化,雖然10、100 mg/L標(biāo)本的批內(nèi)精密度和總精密度,以及200 mg/L標(biāo)本的批內(nèi)精密度標(biāo)本在添加副波長后仍未達到廠商規(guī)定的允許不精密度要求,但是添加副波長前標(biāo)本的驗證試驗結(jié)果均明顯高于添加后,說明添加副波長后相關(guān)的干擾因素得以消除或降低,檢測值的穩(wěn)定性得以明顯改善。并且無論有無添加副波長,不精密度都會隨著標(biāo)本濃度的增加而減小,即使在添加了副波長之后,濃度在10、100 mg/L及部分200 mg/L的標(biāo)本精密度驗證結(jié)果仍然高于廠商聲明的標(biāo)準(zhǔn),說明該試劑在中低濃度,尤其低濃度區(qū)間的檢測值穩(wěn)定性較差。此外,正常的尿微量清蛋白反應(yīng)曲線一般比較平滑,無明顯跳點。而在加入副波長之前,分別加入R1試劑、尿液標(biāo)本及R2試劑后均存在明顯的跳點,說明在加入R1和R2之后均存在一個明顯的干擾。而在添加副波長之后,這兩個跳點均消失,曲線平滑,說明干擾被消除或有效降低。

由于尿微量清蛋白的允許不精密度要求無可供參考的衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),因此,總精密度可參考衛(wèi)生與計劃生育委員會臨檢中心的1/3室間質(zhì)評標(biāo)準(zhǔn)(允許總不精密度誤差TEa)作為總允許不精密度要求[8],批內(nèi)精密度參考1/4TEa,這樣也能夠表明該項目的室內(nèi)質(zhì)量控制監(jiān)測項目允許不精密度要求符合質(zhì)量目標(biāo)。2018年臨床檢驗室間質(zhì)量評價計劃尿微量清蛋白的允許總誤差為30%,因此,尿微量清蛋白的總精密度應(yīng)<10%,批內(nèi)精密度應(yīng)<7.5%,本研究發(fā)現(xiàn)添加副波長前200 mg/L標(biāo)本的總精密度，以及400 mg/L的批內(nèi)精密度和總精密度均符合本實驗室的參考允許不精密度的要求。而添加副波長后100、200、400 mg/L尿液標(biāo)本的批內(nèi)精密度及總精密度均符合本實驗室參考的允許不精密度的要求,表明除低濃度外,部分標(biāo)本雖未通過廠商聲明的允許不精密度,但并未超出本實驗室的允許不精密度標(biāo)準(zhǔn),而部分標(biāo)本未通過精密度驗證的原因有待進一步研究,可能是儀器造成的,因為在生化分析儀上進行免疫學(xué)測定,其不精密度可能比在特定蛋白儀上要大,但不排除部分國產(chǎn)試劑精密度性能指標(biāo)可能存在虛標(biāo)。除此以外,本研究還發(fā)現(xiàn)隨著尿微量清蛋白水平的增加,尤其是濃度在200 mg/L以上的標(biāo)本,不精密度值在添加副波長前后的變化明顯小于低濃度區(qū)域,表明副波長對低濃度標(biāo)本精密度的影響大于高濃度。