張明波 李立莉 盧愛國 袁明霞 張明艷 徐世文

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，黑龍江哈爾濱 150069）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒HuN4-F112株在Marc-145細(xì)胞上最佳增殖條件的研究

張明波1，2李立莉2盧愛國2袁明霞2張明艷2徐世文1＊

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，黑龍江哈爾濱 150069）

為了在Marc-145細(xì)胞上獲得更高滴度的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）HuN4-F112株，優(yōu)化了細(xì)胞培養(yǎng)條件、病毒接種劑量、收毒時(shí)間和病毒液凍融次數(shù)等條件。結(jié)果證明Marc-145細(xì)胞在MEM培養(yǎng)基、新生牛血清含量8%、細(xì)胞接毒密度1.5×105個(gè)/mL、pH 7.1條件下生長狀態(tài)最好；PRRSV HuN4-F112株的最佳接種劑量為3.0×105TCID50/mL，收毒時(shí)間為接種后70～72小時(shí)，在-18℃凍融3次，PRRSV HuN4-F112株增殖效果最好。該結(jié)果為HuN4-F112株P(guān)RRSV疫苗的生產(chǎn)提供了依據(jù)。

PRRSV；HuN4-F112株；Marc-145細(xì)胞；增殖條件

豬繁殖與呼吸綜合征（porcinere productive and respiratory syndrom，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV） 引起的，1992年國際獸醫(yī)局（OIE）將其正式命名，該病主要臨床特征是引起母豬繁殖障礙和仔豬呼吸困難。OIE將該病列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病[1]。該病在世界范圍內(nèi)已流行近30年，僅在美國每年因P R R S給養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失就達(dá)5.6億～7.6億美元[2,3]。我國于1996年確認(rèn)存在豬繁殖與呼吸綜合征。2006年，我國出現(xiàn)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4,5]。目前，該病已成為我國養(yǎng)豬業(yè)的第一大疫病。

為預(yù)防和控制該病，農(nóng)業(yè)部組織有關(guān)單位先后進(jìn)行了PRRSV滅活疫苗（N V D C-J X A 1株） 和凍干活疫苗（HuN4-F 112株）的研究和試生產(chǎn)。目前，預(yù)防此病的主要產(chǎn)品是凍干活疫苗（HuN4-F 112株）[6]，培養(yǎng) PRRSV常用的細(xì)胞為Marc-145細(xì)胞系。本研究旨在探索PRRSVHuN4-F 112株在Marc-145細(xì)胞上的最佳增殖條件，為PRRSVHuN4-F 112株活疫苗的生產(chǎn)提供培養(yǎng)條件依據(jù)，為在合適的生產(chǎn)成本條件下進(jìn)行規(guī)?；呙缟a(chǎn)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 毒株及主要材料

毒株HuN4-F 112株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，Marc-145細(xì)胞購自美國ATCC公司，ME M培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品，新生犢牛血清為山東勁牛生物科技有限公司產(chǎn)品，胰酶為美國Gibco公司產(chǎn)品，48孔細(xì)胞培養(yǎng)板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶為Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

1.2 儀器設(shè)備

倒置顯微鏡為奧林帕斯顯微鏡，無菌操作間和恒溫培養(yǎng)間為新通過G MP驗(yàn)收的生產(chǎn)車間萬級(jí)（局部百級(jí)）無菌室及培養(yǎng)室，C O2培養(yǎng)箱為日本三洋公司產(chǎn)品，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)機(jī)為藍(lán)州飛控器械總廠產(chǎn)品。

2 方法

2.1 血清質(zhì)量檢測及滅活

每一批血清在使用之前先要進(jìn)行無菌、支原體和牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）的檢驗(yàn)，檢測結(jié)果均為陰性才能用于Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)，每瓶血清使用前于65℃水浴滅活30分鐘。

2.2 細(xì)胞的復(fù)蘇及傳代培養(yǎng)

自液氮罐中取出安瓶凍結(jié)的生產(chǎn)用細(xì)胞，立即置于37℃恒溫水浴槽中，輕搖使細(xì)胞融化，1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，倒去上清加入細(xì)胞生長液吹打，無菌吸出細(xì)胞懸液加入到T 75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入細(xì)胞生長液，37.5℃培養(yǎng)至形成單層細(xì)胞。

棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入0.25%胰酶2～4mL對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，至細(xì)胞接近霧化時(shí)迅速棄去胰酶，加入30mL培養(yǎng)液，用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，將懸液分成3瓶，置37.5℃下繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞貼壁生長情況。待細(xì)胞長至單層繼續(xù)傳代或用于試驗(yàn)[7]。

2.3 病毒的復(fù)壯

取長成單層的Marc-145細(xì)胞，棄去營養(yǎng)液，加入稀釋好的病毒液，補(bǔ)加維持液，置于37.5℃下培養(yǎng)；每天觀察細(xì)胞病變（C P E），當(dāng)C P E達(dá)到80%時(shí)，凍融2次，于-20℃保存。

2.448 孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞

培養(yǎng)瓶中長成單層的細(xì)胞傳代時(shí)，按106個(gè)/mL細(xì)胞濃度以每孔400μL細(xì)胞懸液加入到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后輕輕振蕩細(xì)胞培養(yǎng)板，使細(xì)胞分散均勻，置于體積分?jǐn)?shù)為5%的C O2培養(yǎng)箱中于37.5℃培養(yǎng)。

2.5 病毒含量（TCID50） 的測定

將待測定病毒按10倍系列稀釋至10-7，取 10-5、10-6、10-7三個(gè)稀釋度各100μL，加入長成單層的48孔Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)板，同時(shí)設(shè)未接毒細(xì)胞陰性對(duì)照和稀釋濃度為10-1的病毒陽性對(duì)照。參照R e e d-Mu e n c h法[5]，測定和計(jì)算TCID50。

2.6 細(xì)胞生長液最佳血清含量測定

分別使用血清含量為2%、5%、8%、10%四個(gè)濃度的ME M培養(yǎng)基培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞，48小時(shí)后棄去營養(yǎng)液，接種病毒液1mL于T 75瓶。加入含3%血清含量的ME M培養(yǎng)基，逐日觀察C P E，當(dāng)C P E達(dá)70%～80%時(shí)收獲病毒液，于-18℃反復(fù)凍融3次，分別測定病毒TCID50，以其中TCID50最高者為細(xì)胞生長液最佳血清含量。

2.7 MEM培養(yǎng)基最佳pH測定

將含8%犢牛血清的ME M培養(yǎng)基p H值 調(diào) 整 為 6.6、 6.9、 7.0、 7.1、7.2、7.3、7.4、7.6、7.8，分別作為生長液用于培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞，接毒、收獲和判定標(biāo)準(zhǔn)同前，分別測定病毒TCID50，以其中TCID50最高者為最佳p H[1]。

2.8 最佳細(xì)胞接種密度試驗(yàn)

將消化、分散后的細(xì)胞濃度分別調(diào)整為約 5.0×104、1.0×105、1.5×105、2.0×105、2.5×105、3.0×105個(gè) /mL六個(gè)濃度，分別取等量（10mL） 置于T 75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細(xì)胞長成單層時(shí)分別接毒，接毒劑量、收毒和判定標(biāo)準(zhǔn)同前，以確定適合細(xì)胞生長與病毒增殖的最佳細(xì)胞密度。

2.9 最佳接毒劑量試驗(yàn)

分別以 1.5×105、2.0×105、2.5×105、3.0×105、4.0×105TCID50/mL五個(gè)劑量接種病毒于已長成單層細(xì)胞的T 75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，收毒和判定標(biāo)準(zhǔn)同前，分別測定病毒TCID50，以其中TCID50最高者為最佳接毒劑量。

2.10 病毒凍融次數(shù)試驗(yàn)

收毒后，分別在-18℃條件下凍融1、2、3、4、5、6次，測定病毒TCID50，以其中TCID50最高者為病毒凍融次數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 病毒復(fù)壯后病毒滴度

病毒復(fù)壯后，其滴度為107.17TCID50/mL。

3.2 細(xì)胞生長液最佳血清含量

從表1可以看出，取8%作為ME M培養(yǎng)基中犢牛血清的最佳含量。

3.3 MEM培養(yǎng)基最佳pH值

當(dāng)p H值為7.0～7.1時(shí)，細(xì)胞生長狀態(tài)正常，接毒后產(chǎn)毒滴度為107.17TCID50/mL?？紤]病毒復(fù)制后p H值易減小的因素，所以取p H7.1為病毒復(fù)制最佳p H值（表2）。

3.4 最佳細(xì)胞接毒密度

從表3可見，病毒滴度與細(xì)胞接種量無線性關(guān)系。細(xì)胞密度在1.5×105個(gè) /mL時(shí)，其 TCID50最高（107.37TCID50/mL），因此取細(xì)胞密度在1.5×105個(gè)/mL為最佳細(xì)胞接毒密度。

表1 細(xì)胞生長液最佳血清含量的測定

3.5 最佳接毒劑量試驗(yàn)

從表4可以看出，接毒量為3.0×105TCID50/mL時(shí)，細(xì)胞所產(chǎn)病毒液TCID50較高（107.33TCID50/mL），因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中取3.0×105TCID50/mL為最佳接毒劑量。

表2 MEM培養(yǎng)基最佳pH值的測定

表3 最佳細(xì)胞接毒密度的測定

表4 最佳接毒劑量的測定

表5 最佳凍融次數(shù)的測定

表6 最佳收毒時(shí)間的測定

3.6 最佳凍融次數(shù)試驗(yàn)

當(dāng)凍融次數(shù)為3次時(shí)，病毒TCID50最高（107.17TCID50/mL）。因此取凍融3次作為最佳凍融次數(shù)（表5）。

3.7 最佳收毒時(shí)間試驗(yàn)

在70～72小時(shí)，鏡下觀察C P E基本達(dá)到80%～85%，經(jīng)檢測此時(shí)病毒TCID50為107.17/mL，達(dá)到最高值，因此取病毒感染細(xì)胞后70～72小時(shí)作為最佳收毒時(shí)間（表6）。

4 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)

按以上所有最佳條件在10L轉(zhuǎn)瓶中用1L液體繼續(xù)培養(yǎng)，獲取最佳病毒滴度為107.5TCID50，說明轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)相比較靜止培養(yǎng)，能夠更好地促進(jìn)病毒充分獲取營養(yǎng)及提高病毒在細(xì)胞機(jī)體內(nèi)的復(fù)制機(jī)能。

5 討論

Marc-145細(xì)胞作為PRRSV HuN4-F 112株復(fù)制的載體，其生長形態(tài)、健康狀況、培養(yǎng)液的各項(xiàng)理化指標(biāo)對(duì)病毒的增殖有較大影響，甚至連收毒時(shí)間、凍融次數(shù)等也可以成為影響病毒滴度的關(guān)鍵因素。但值得注意的是，當(dāng)用于接種的病毒效價(jià)越高，需接種的病毒量、接毒時(shí)間、細(xì)胞密度等因素都會(huì)隨之改變，所以穩(wěn)定的種毒也是疫苗規(guī)?；a(chǎn)中的關(guān)鍵因素。

[1]朱文革,賀云霞,周振成,等.PRRSV N V D C-J X A 1株在Marc-145細(xì)胞上增殖條件的優(yōu)化.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010,31(6):66-69.

[2]張建新,王旭田,司獻(xiàn)軍.高致病性豬藍(lán)耳病及其防控.中國動(dòng)物保健，2007(7):17-19.

[3]鄧富江.大力發(fā)展生豬養(yǎng)殖 滿足人民肉食需求.肉類工業(yè),2008,324(4):1-2.

[4]張銀田.我國高致病性豬藍(lán)耳病疫情及防控情況.獸醫(yī)導(dǎo)刊,2007,119(7):12-14.

[5]藍(lán)海楠,張輝,崔煥忠,等.Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)條件摸索及其初步應(yīng)用.中國畜牧獸醫(yī),2011,38(5):220-223.

[6]湯景元,姜平,蔣文明,等.表達(dá)PRRSVM蛋白重組腺病毒的構(gòu)建及其免疫特性的研究.中國病毒學(xué),2005,20(6):618-622.

[7]R.I.弗雷謝尼（英）.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)指南 (第五版).章靜波,徐存拴等譯.北京：科學(xué)出版社,2012.

S858.28

B

1673-4645（2013）07-0038-03

2013-05-29

張明波，男，黑龍江人，碩士生，研究方向：動(dòng)物醫(yī)學(xué)

徐世文，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：臨床獸醫(yī)學(xué)